《Journal of Diabetes Investigation》：USP18 mediates high glucose-induced cardiomyocyte injury by regulating the JAK/STAT signaling pathway through stabilizing FOXC2 expression
ABSTRACT
背景
糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病的常见并发症，心肌纤维化是其典型特征。泛素特异性蛋白酶18(USP18)是一种去泛素化酶。多项研究表明其可能具有保护糖尿病状态下心肌损伤的潜力，但具体机制尚不清楚。
方法
本研究采用高糖(HG)处理新生小鼠心室肌细胞(NMVMs)以诱导糖尿病心肌损伤模型，并通过定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)和蛋白质印迹法检测基因表达。使用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)、相应试剂盒、流式细胞术、酶联免疫吸附试验(ELISA)和DCFH-DA探针检测细胞表型。此外，通过免疫荧光(IF)和蛋白质印迹实验反映细胞纤维化。分别应用泛素化分析和放线菌酮(CHX)实验评估蛋白质泛素化和降解。
结果
USP18在HG诱导的NMVMs中表达下调，而过表达USP18可促进HG暴露下NMVMs的活力并抑制其凋亡。同时，HG促进的NMVMs炎症、氧化应激和纤维化在USP18上调后被逆转。在机制上，USP18通过减少叉头框蛋白C2(FOXC2)的泛素化来稳定其表达，进而通过Janus激酶/信号转导和转录激活因子(JAK/STAT)通路参与调节NMVMs的活力、凋亡、炎症、氧化应激和纤维化。
结论
USP18通过抑制FOXC2的泛素化以稳定其表达，从而通过JAK/STAT通路介导HG诱导的心肌损伤。
INTRODUCTION
糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者的典型并发症，常见症状为心脏功能和结构异常，具有较高的发病率和死亡率。心肌纤维化是DCM的一个突出特征，由心脏成纤维细胞产生的细胞外基质积聚引起。探索糖尿病诱导心肌损伤的机制并寻求有效的防治手段具有重要意义。
泛素特异性蛋白酶18(USP18)是属于泛素特异性蛋白酶家族的去泛素化酶，通过去除靶蛋白的泛素化修饰来调节其稳定性和功能，从而调控多种信号通路。USP18在多种疾病中发挥作用，如癌症、心血管疾病和免疫代谢疾病。已有报道称，泛素-蛋白酶体系统在DCM中具有潜在的治疗意义。此外，USP18的表达在糖尿病小鼠的心脏组织中下调。Feng等人发现，USP18的下调会干扰小豆蔻对心肌重塑的保护作用，而其过表达则会增强这种作用。上述研究表明USP18可能具有保护糖尿病心肌损伤的潜力。
叉头框蛋白C2(FOXC2)是一种转录因子，参与多种生理过程，包括上皮-间质转化、脂质代谢和胚胎发育。据报道，FOXC2在多种癌症中经常失调并作为癌基因发挥作用。同时，FOXC2与妊娠期糖尿病的胰岛素抵抗有关。此外，FOXC2是心肌损伤的保护因子，对心室发育也至关重要。然而，FOXC2是否参与USP18对糖尿病心肌损伤的调节尚不清楚。
本研究旨在从新生小鼠中提取心肌细胞，在体外阐明USP18在高糖(HG)刺激下调节心肌损伤的机制，为DCM的治疗提供新靶点。
MATERIALS AND METHODS
细胞分离和培养
根据先前研究，采用成熟的酶消化方案从C57BL/6J小鼠(1-3天)中提取新生小鼠心室肌细胞(NMVMs)。简而言之，分离心室组织，切碎并进行酶消化以解离心肌细胞。然后将细胞培养在添加了10%胎牛血清和100 IU/mL青霉素/链霉素的DMEM培养基中。高糖(HG)组的NMVMs在含有35 mmol/L D-葡萄糖的DMEM培养基中培养。对于蛋白质降解分析，用放线菌酮(CHX)处理NMVMs不同时间(0, 2, 4, 6小时)。细胞应在2周内传代并进行实验处理。从小鼠提取细胞的过程符合河北北方学院第一附属医院动物伦理委员会的规定。
定量逆转录聚合酶链反应(RT-qPCR)
使用Trizol分离RNA。测量RNA浓度后，应用Hifair? AdvanceFast第一链cDNA合成试剂盒进行逆转录。然后将cDNA与引物和SYBR Green I混合制备qPCR反应液，并基于以下程序进行qPCR：预变性，95°C 2分钟；变性，95°C 15秒；退火/延伸，60°C 20秒；40个循环。以GAPDH为内参基因，通过2-ΔΔCt法计算基因表达量。引物序列见表1。
蛋白质印迹法
使用添加了PMSF的RIPA裂解缓冲液分离蛋白质。然后将蛋白质与5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液混合，并在100°C下煮沸10分钟。蛋白质条带分离后，转移到PVDF膜上，并用快速封闭液封闭。先后与一抗(抗-USP18, 1:1,000；抗-胶原蛋白I(Col I), 1:5,000；抗-Col III, 1:1,000；抗-FOXC2, 1:1,000；抗-磷酸化JAK2(pJAK2), 1:5,000；抗-JAK2, 1:5,000；抗-磷酸化STAT3(pSTAT3), 1:10,000；抗-STAT3, 1:2,000；抗-GAPDH, 1:2,500)在4°C孵育12小时，以及与二抗(1:50,000)在4°C孵育2小时。在ChemiDoc?成像系统下获取图像。
过表达载体和小干扰(si)RNA的构建与转染
靶向USP18的过表达载体(oe-USP18)、FOXC2的siRNA(si-FOXC2)及相应的阴性对照(oe-NC和si-NC)由Genscript合成。根据不同实验要求，使用Hieff Trans?通用转染试剂将上述载体或siRNA转染到细胞中。
细胞计数试剂盒-8(CCK-8)
将细胞铺入96孔板并用不同条件处理。加入CCK-8溶液后，将细胞在37°C、5% CO2的细胞培养箱中孵育，然后检测450 nm处的吸光度。
腺苷5'-三磷酸(ATP)测定
将细胞接种到六孔板中并用不同条件处理。基于ATP检测试剂盒，裂解处理后的细胞，离心后收集细胞上清液。制备标准曲线后，将ATP检测液加入检测管中反应4分钟以消耗背景ATP。然后向管中加入样品或标准品，并在至少2秒后使用发光计检测ATP相对发光单位(RLU)值。
流式细胞术
应用膜联蛋白V-FITC凋亡检测试剂盒，在流式细胞术下检测细胞凋亡。收集处理过的细胞，用磷酸盐缓冲液(PBS)重悬进行细胞计数。离心后，依次将细胞沉淀与膜联蛋白V-FITC结合液、膜联蛋白V-FITC以及碘化丙啶混合并反应。避光孵育15分钟后，使用流式细胞仪检测细胞凋亡。
酶联免疫吸附试验(ELISA)
使用相应的ELISA试剂盒测定肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-6(IL-6)和IL-1β的水平。简而言之，收集细胞培养上清液并在4°C、1000×g下离心20分钟以收集上清样品。将微孔板分为标准孔、空白孔和样品孔，分别加入标准品、样品稀释液和上清样品。在37°C孵育90分钟后，向每孔加入生物素化检测抗体稀释液，反应1小时。依次使用浓缩HRP结合物和底物试剂在37°C反应30分钟和15分钟。加入终止液终止反应后，检测每孔在450 nm处的光密度。
活性氧(ROS)评估
使用ROS检测试剂盒分析ROS水平。从细胞培养板中移除细胞培养液，然后加入稀释的DCFH-DA并在37°C下反应20分钟。使用显微镜测量荧光强度。
超氧化物歧化酶(SOD)和过氧化氢酶(CAT)评估
分别应用NBT法总超氧化物歧化酶检测试剂盒和过氧化氢酶检测试剂盒检测SOD和CAT的活性。对于SOD检测，收集细胞并在预冷的PBS中匀浆。然后在4°C离心，上清液用作样品。在96孔板中设置样品孔、空白1孔和空白2孔。样品孔加入20 μL样品、160 μL NBT/酶工作液和20 μL反应启动工作液；空白1孔加入20 μL SOD检测缓冲液、160 μL NBT/酶工作液和20 μL反应启动工作液；空白2孔加入40 μL SOD检测缓冲液和160 μL NBT/酶工作液。在37°C孵育30分钟后，在560 nm处检测吸光度。根据制备的标准曲线计算SOD活性。对于CAT测定，用RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并用过氧化氢酶检测缓冲液稀释。将样品与过氧化氢酶检测缓冲液和过氧化氢溶液混合，在25°C下反应5分钟。使用过氧化氢酶反应终止液终止反应，并在15分钟内加入过氧化氢酶检测缓冲液和显色工作液。在25°C孵育20分钟后，检测520 nm处的吸光度，并使用制备的标准曲线定量CAT活性。
免疫荧光(IF)
用4%中性福尔马林固定处理过的细胞，然后用Triton X-100进行透化处理。用5%牛血清白蛋白(BSA)封闭30分钟后，依次与一抗(抗-Col I, 1:100或抗-Col III, 1:100)在4°C过夜孵育，以及与二抗(1:1000)在37°C孵育1小时。随后用4',6-二脒基-2-苯基吲哚(DAPI)在37°C避光染色10分钟对细胞核进行染色，在显微镜下观察细胞。
在线数据库分析
应用ubibrowser网站预测USP18的潜在靶点。
泛素化分析
使用含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解缓冲液裂解细胞，并进行超声波处理。将抗-FOXC2与Protein A/G琼脂糖珠结合形成抗体-珠复合物，将该复合物加入样品中，使抗体特异性结合泛素化底物。用洗涤缓冲液洗涤抗体-珠复合物以去除非特异性结合的蛋白质。沉淀的蛋白质在SDS-PAGE下分离。使用抗-泛素抗体和抗-FOXC2进行蛋白质印迹分析。
统计分析
应用GraphPad Prism软件分析数据，并使用Student's t检验和方差分析评估两组或多组之间的差异。P < 0.05表示具有显著性。
RESULTS
USP18减轻HG对NMVMs活力和凋亡的影响
与对照组相比，USP18在HG处理的NMVMs中低表达(图1a, b)。转染oe-USP18后，与oe-NC组相比，NMVMs中USP18表达上调(图1c, d)。在HG环境下，NMVMs的活力下降，而USP18过表达逆转了这种下降(图1e)。此外，HG抑制的NMVMs中ATP水平在转染oe-USP18后得以恢复(图1f)。同时，HG引起的细胞凋亡增加被oe-USP18削弱(图1g)。因此，USP18减弱了HG诱导的NMVMs活力抑制和凋亡促进。
USP18缓解HG诱导的NMVMs炎症、氧化应激和纤维化
暴露于HG后，NMVMs上清液中促炎因子(TNF-α, IL-6, IL-1β)的水平升高，而过表达USP18后这些水平降低(图2a–c)。此外，USP18抑制了HG引起的ROS水平升高(图2d, e)以及SOD和CAT水平降低(图2f, g)。因此，HG诱导的炎症和氧化应激被USP18过表达所减轻。进一步探究了USP18对HG诱导的NMVMs纤维化的影响。HG暴露诱导的Col I和Col III表达增强在过表达USP18的NMVMs中被抑制，这通过IF和蛋白质印迹结果得以体现(图3a, b)。总的来说，USP18改善了HG触发的NMVMs纤维化。
USP18抑制FOXC2泛素化以增强其表达
本研究通过ubibrowser网站预测FOXC2是USP18的靶点(图S1)，蛋白质印迹结果显示FOXC2的表达被HG暴露所抑制，但随着USP18的上调而被逆转(图4a)。此外，如图4b所示，USP18过表达后FOXC2的泛素化水平降低。另外，使用CHX检测NMVMs中FOXC2蛋白的降解。结果表明，NMVMs中FOXC2的表达与CHX处理时间呈负相关；此外，与HG + oe-NC组相比，HG + oe-USP18组中的FOXC2表达更高(图4c)。因此，USP18通过去泛素化促进FOXC2的表达。
FOXC2通过JAK/STAT通路减弱USP18介导的对HG暴露下NMVMs的影响
为探究USP18和FOXC2在HG诱导的NMVMs中的作用机制，进行了回复实验。转染si-FOXC2后，HG诱导的NMVMs中FOXC2表达降低(图5a)。USP18引发的HG暴露下NMVMs活力和ATP增加被FOXC2敲低所抑制(图5b, c)。除此之外，USP18在HG诱导的NMVMs中介导的细胞凋亡(图5d)和促炎因子水平(图5e–g)的降低，在沉默FOXC2后得到缓解。同时，FOXC2沉默消除了由USP18上调导致的HG暴露下NMVMs中ROS水平下降以及SOD和CAT水平上升(图5h–j)。由USP18过表达引起的NMVMs纤维化抑制(表现为Col I和Col III表达减少)也因FOXC2缺失而得到改善(图5k)。总之，敲低FOXC2逆转了USP18对HG诱导的NMVMs的影响。JAK/STAT信号通路在炎症性疾病、心肌纤维化等疾病中起着重要作用，因此检测了USP18/FOXC2对JAK/STAT信号通路的影响。如图6所述，HG诱导的NMVMs中pJAK2/JAK2和pSTAT3/STAT3比值增加被USP18过表达所减弱，而这一效应在FOXC2敲低后被逆转。上述结果表明，USP18/FOXC2轴可能通过JAK/STAT信号通路调节HG诱导的NMVMs的表型。
DISCUSSION
心肌细胞凋亡是DCM发展过程中的一个表型，尤其是在初始阶段，而慢性炎症是重要的诱导因素。此外，先前研究表明，HG环境可诱导ROS释放并刺激NF-κB活性，从而介导炎症因子的转录活性。与此一致，本研究认为HG暴露可抑制NMVMs的活力，促进细胞凋亡和炎症因子释放以及氧化应激的发生。在HG刺激下，氧化应激和炎症刺激心肌胶原蛋白的产生，诱导纤维化的发生。纤维化进一步诱导更多炎症因子的释放，从而加剧纤维化进程。同样，本研究发现HG诱导了胶原蛋白的产生，表明HG刺激了心肌纤维化。
作为一种去泛素化酶，USP18被发现可缓解LPS诱导的人肺微血管内皮细胞的氧化应激和炎症。此外，USP18可能通过调节炎症反应和细胞凋亡来保护PC12细胞免受氧-葡萄糖剥夺/再灌注诱导的损伤。USP18降低了冠状动脉内皮细胞的基础炎症、衰老和胰岛素抵抗。除此之外，一项综合分析揭示，USP18可作为与小鼠模型应激诱导的心脏损伤相关的关键靶点。有趣的是，在本研究中，过表达USP18减缓了HG诱导的NMVMs凋亡、炎症、氧化应激和纤维化，表明USP18减轻了HG暴露引起的心肌损伤，并支持了先前关于USP18在病理性心脏重塑中具有保护作用的发现。
为了进一步探索USP18在DCM中的作用机制，预测了USP18的潜在靶点FOXC2。FOXC2在心脏疾病中起着重要作用。例如，FOXC2在神经嵴细胞中的条件性失活会导致心脏异常。此外，在心脏流出道发育异常引起的先天性心脏病亚型圆锥动脉干心脏缺陷患者中发现了功能受损的FOXC2变异体。FOXC2还与2型糖尿病中的肝葡萄糖和脂质代谢紊乱有关。更重要的是，FOXC2通过核因子E2相关因子2/血红素加氧酶1(Nrf2/HO-1)通路减轻了心肌缺血-再灌注损伤。因此，本研究假设USP18可通过促进FOXC2的去泛素化来稳定FOXC2的表达，从而对HG诱导的心肌细胞发挥保护作用。通过泛素化分析和CHX实验验证了两者之间的泛素化调控。此外，进一步研究提出，下调FOXC2可削弱USP18在HG背景下对心肌损伤和纤维化的缓解作用。
JAK/STAT信号通路是心血管疾病的一个有前景的靶点，并在炎症性疾病、心肌纤维化等疾病中起着关键作用。此外，已知抑制JAK/STAT信号通路可减轻糖尿病心肌损伤。本研究进一步检测了USP18/FOXC2对JAK/STAT信号通路的影响。本研究发现USP18抑制了HG激活的JAK/STAT信号通路，而这一效应在FOXC2敲低后得以恢复。因此，USP18通过阻断JAK/STAT通路的激活来调节FOXC2的泛素化，从而减轻HG刺激下心肌损伤的发生。
综上所述，本研究通过在体外将NMVMs暴露于HG环境来诱导DCM模型，探索了USP18对心肌损伤的保护作用。这些发现表明，USP18通过去泛素化稳定FOXC2，从而通过JAK/STAT通路发挥心肌保护作用。这为DCM进展的进一步体内研究和DCM的治疗提供了新的靶点参考。然而，该机制是否能在体内和临床治疗中真正应用仍有待探索。
DISCLOSURE
作者声明无利益冲突。
研究方案批准：本研究经河北北方学院第一附属医院伦理审查委员会批准。所有入组患者均获得书面知情同意。
知情同意：所有入组患者均获得书面知情同意。
研究/试验注册号：20240318。
动物研究：动物研究遵循ARRIVE指南和《巴塞尔宣言》进行。所有动物均根据美国国立卫生研究院的指南得到人道关怀。
DATA AVAILABILITY STATEMENT
支持本研究结果的数据可根据合理要求从通讯作者处获得。
