黄瓜基质中矮壮素与2,4-滴残留测定用新型标准物质的研制与表征

《Foods》：A New Matrix Certified Reference Material for Measurement of Chlormequat Chloride and 2,4-Dichlorophenoxyacetic Acid Residues in Cucumber Ling Li, Qi Xu, Haochuan Shi, Mengrui Yang, Jingjing Yan, Jian Zhou, Fukai Li, Liang Li and Min Wang

本文报道了一种用于检测黄瓜中植物生长调节剂（PGRs）矮壮素（CCC）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）残留的新型基质标准物质（CRM）的研制与认证。研究遵循ISO Guide 35:2017规范，通过黄瓜制浆、加标、均质与分装制备了候选CRM，并建立了同位素稀释-液相色谱-串联质谱（ID-LC-MS/MS）方法用于同步测定及联合定值。对材料的均匀性、长期（-20°C，14个月）与短期稳定性（4°C与30°C，9天）进行了系统评估，确定了认证值（CCC: 4.1±0.4 mg/kg, 2,4-D: 2.0±0.2 mg/kg）及其扩展不确定度。该工作填补了高水分果蔬基质中相关PGRs检测用有证标准物质的空白，为保障农产品安全相关分析方法的质量控制与验证提供了可靠工具。

　　

引言

植物生长调节剂（PGRs）是调控植物生理过程的一类化合物，在现代农业中广泛应用。然而，许多PGRs具有亚急性或慢性毒性，其残留可能对人体健康构成风险。矮壮素（CCC）是一种季铵盐类植物生长调节剂，能控制株高、提高产量，但可能对哺乳动物生殖功能产生不良影响，并被美国国家职业安全与健康研究所（NIOSH）列为疑似内分泌干扰物。2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）是一种合成的生长素类似物，具有潜在致癌、致突变性，并可干扰内分泌、生殖和免疫系统。为确保食品安全，包括中国、欧盟、美国、日本在内的许多国家和地区均对水果蔬菜中CCC和2,4-D设定了最大残留限量（MRLs）。分析方法的准确性至关重要，而使用基质匹配的有证标准物质（CRMs）是验证方法准确性和可靠性的有效途径。目前，针对高水分黄瓜基质中CCC和2,4-D残留检测的CRM尚属空白，本研究旨在开发一种满足此需求的黄瓜浆体CRM。

材料与方法

材料：所用标准品包括2,4-D纯度标准物质（GBW09291）和CCC溶液标准物质（GBW(E)081910）。同位素内标为CCC-D₄和2,4-D-D₃。主要仪器包括超高效液相色谱系统与串联质谱仪联用系统。

CRM候选物制备：选取市售新鲜黄瓜，经清洗、切块、确认本底无目标物残留后，制浆。将CCC和2,4-D标准溶液加入黄瓜浆体中，经过40分钟滚动混合确保充分均质，然后分装至食品级铝箔袋中（每袋20g），于-20°C储存。共制备200个单元。

样品前处理：准确称取2.00g黄瓜浆，加入同位素内标溶液，以含1%甲酸的乙腈25mL提取，离心、过滤后供仪器分析。

ID-LC-MS/MS分析：采用Waters XBridge C₁₈色谱柱分离。流动相为（A）含0.2%乙酸和5mM乙酸铵的水溶液与（B）含0.2%乙酸的乙腈。质谱检测采用电喷雾离子源（ESI），正/负离子切换模式和多反应监测（MRM）。CCC在正离子模式下检测，2,4-D在负离子模式下检测。研究优化了提取溶剂、体积及净化条件，确定使用酸化乙腈提取，无需净化步骤即可满足高浓度样品的测定要求。

定值方法学：依据JJF 1343–2022，由8家权威合作实验室使用建立的ID-LC-MS/MS参考方法进行协同定值。每家实验室分析随机分配的3个CRM单元，每个单元测定3份子样。

均匀性与稳定性评估：均匀性评估随机选取15个单元，通过单因素方差分析（ANOVA）进行统计，确定最小取样量为2.0g。长期稳定性在-20°C下监测14个月，短期稳定性在4°C和30°C下监测9天，采用回归分析评估趋势。

结果与讨论

CRM候选物制备：为满足方法验证和质量控制需求，目标浓度设定为检测限的3-5倍，最终CCC和2,4-D在黄瓜浆中的目标浓度范围分别为3-5 mg/kg和1.5-2.5 mg/kg。均质化效率评估表明，混合40分钟后目标物测量结果的标准偏差显著降低，故采用40分钟作为最优均质时间。冻融稳定性测试（3个循环）表明，CCC和2,4-D浓度保持稳定，标准偏差小，表明在标准操作条件下（≤3个循环，使用前涡旋）无明显影响。

ID-LC-MS/MS方法优化与验证：方法在各自浓度范围内线性良好（CCC和2,4-D的相关系数R²分别为0.9990和0.9991）。采用单点校准的ID-LC-MS/MS法，其组内和组间相对标准偏差（RSD）均在5%左右，重复性和精密度良好。加标回收率（CCC: 100.4%-101.1%; 2,4-D: 97.0%-105.1%）满足定值要求。基质效应评估表明，目标物及其同位素内标的基质效应值均接近1，表明使用同位素内标有效补偿了基质效应。方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ）分别为：CCC 1.26/4.19 μg/kg，2,4-D 2.67/8.91 μg/kg。

定值：协同定值数据经Dixon检验和Cochran检验，确认无离群值且实验室间方差一致。CCC和2,4-D的认证值分别定为4.1 mg/kg和2.0 mg/kg，为所有实验室测量结果均值的平均值。该浓度高于黄瓜中相应的最大残留限量（MRLs）（中国标准：CCC 1.0 mg/kg, 2,4-D 0.5 mg/kg），目的是确保CRM生产过程中良好的均匀性和稳定性，适用于中等浓度水平的方法验证。稳健统计结果（中位数和归一化中位数绝对偏差MADn）与算术平均值及标准偏差高度一致，证实了认证值的可靠性。

均匀性与稳定性：均匀性测试的统计结果表明，CRM候选物在袋间和袋内对于CCC和2,4-D均是均匀的，最小取样量为2g。长期稳定性监测（-20°C，14个月）显示，CCC和2,4-D的浓度无显著变化趋势。短期稳定性研究表明，CCC在4°C和30°C下储存9天保持稳定。然而，2,4-D在30°C下储存9天后变得不稳定，因此该CRM的运输温度不应超过4°C。结合黄瓜基质的高水分活度，推测2,4-D在30°C下的不稳定性主要归因于微生物降解。

不确定度评估：CRM认证值的不确定度来源主要包括定值（u_char）、均匀性（u_bb）、长期稳定性（u_lts）和短期稳定性（u_sts）引入的不确定度。相对合成标准不确定度u_CRM,rel由这些分量的平方和开方得到。扩展不确定度U_CRM等于u_CRM,rel乘以包含因子k（k=2，对应95%置信水平）。对于CCC，长期稳定性是合成不确定度的最大贡献者；对于2,4-D，定值过程是最大不确定度来源。最终，CCC和2,4-D的认证值及其扩展不确定度分别确定为4.1 mg/kg ± 0.4 mg/kg 和 2.0 mg/kg ± 0.2 mg/kg。该CRM已由中国国家市场监督管理总局正式认证，编号为GBW(E)100932。

结论

本研究成功研制并认证了世界上首个用于黄瓜中矮壮素（CCC）和2,4-二氯苯氧乙酸（2,4-D）残留测定的基质有证标准物质（CRM）。研究建立了高特异性和高灵敏度的ID-LC-MS/MS参考方法，并应用于材料的协同定值、均匀性及稳定性评价。系统的不确定度评估确保了认证值的可靠性。该CRM具有良好的均匀性，在-20°C下长期稳定，但2,4-D组分在30°C以上运输时会不稳定，提示了储存和运输的注意事项。该标准物质的成功开发，为监测黄瓜及其他高水分果蔬中CCC和2,4-D残留的分析实验室提供了至关重要的质量保证工具，对保障食品安全、规范植物生长调节剂的使用具有重要的实际应用价值。