BSA组装的金银双金属纳米簇构建比率荧光传感器用于水体中金霉素的高选择性检测

《Chemosensors》：A Ratiometric Fluorescence Sensor Based on BSA Assembled Gold–Silver Bimetallic Nanoclusters for Highly Selective Detection of Chlortetracycline in Water Yu-Meng Dai, Weidong Ruan and Hong-Wei Li

本综述报道了一种基于BSA组装的金银双金属纳米簇构建的新型比率荧光传感器，用于高选择性检测水体中的金霉素。该传感器利用牛血清白蛋白（BSA）对纳米簇的AIEE（组装诱导发射增强）效应，使其荧光量子产率（QY）从2.50%提升至7.78%，并提供稳定的参考信号（687 nm）。目标物金霉素（CTC）特异性结合BSA后，其自身荧光在420 nm处被显著增强，而纳米簇的红光发射不受影响。该比率探针实现了对CTC的高选择性、高灵敏度（LOD = 20 nM）检测，并能有效区分其他四环素类抗生素，在实际水样检测中展现出良好应用潜力。

　　

1. 引言

四环素类抗生素（TCA）是一类具有四环核心结构的广谱抗生素，包括金霉素（CTC）、土霉素（OTC）、四环素（TC）和多西环素（DC）等。其中，金霉素因其低成本、广谱性，在兽医学和畜牧业中广泛用于治疗和促生长。然而，CTC具有较低的生物利用度和环境降解性，易在水体中持续累积，通过食物链或污染水对人体健康构成潜在威胁，如肝毒性和过敏反应。因此，开发针对CTC的高选择性检测方法具有重要的实际意义。

当前用于检测TCA的常见技术包括高效液相色谱法（HPLC）、毛细管电泳（CE）、免疫层析法和电化学方法。这些方法或涉及复杂的样品前处理、需要昂贵仪器和专业操作人员，或面临灵敏度、抗干扰和多重定量方面的挑战。相比之下，荧光传感技术因其在实现实时、原位、快速和高灵敏度检测方面的潜力而备受关注。然而，由于TCA间结构高度相似，大多数已报道的CTC荧光传感器对其它TCA存在交叉敏感，选择性差。因此，开发能够高选择性识别CTC并有效排除其它TCA干扰的荧光传感器，仍然是一个艰巨的挑战。

本研究团队前期工作发现，近红外发射的巯基丙酸保护的纳米金簇与牛血清白蛋白（BSA）相互作用后，发射强度增强约3倍。受此启发，本工作在合成中引入硝酸银，制备了巯基丙酸保护的金银双金属纳米簇（Au-AgNCs），并研究了其与BSA相互作用的荧光特性。基于TCA本身具有弱荧光，但在与BSA结合后荧光显著增强的现象，将Au-AgNCs与BSA的组装体应用于CTC检测。研究发现，CTC的加入能诱导在420 nm处产生新的蓝色荧光发射峰，而纳米簇原有的红色发射保持不变，且此响应对于其它TCA具有高度特异性，从而构建了一种新型比率荧光传感器。

2. 实验结果与讨论

2.1. Au-AgNCs的制备、优化与表征

金银双金属纳米簇（Au-AgNCs）采用巯基丙酸（TLA）作为配体和还原剂，通过一锅水热法合成。所制备的Au-AgNCs平均直径约为1.85 nm，在465 nm激发下，在687 nm处表现出强烈的红色荧光发射，其绝对荧光量子产率（PLQY）为2.50%。通过系统优化反应时间、温度、NaOH和TLA浓度以及Au/Ag摩尔比，确定了最佳合成条件：110 °C，反应120分钟，Au/Ag摩尔比为8:2，NaOH浓度为4.0 mM，TLA浓度为6.5 mM。透射电子显微镜和X射线光电子能谱表征证实了具有Au(0)/Ag(0)金属核和Au(I)-硫醇盐表面结构的纳米簇的成功合成。

2.2. Au-AgNCs@BSA组装体的形成与性质

将Au-AgNCs与BSA混合后，其荧光强度随BSA浓度增加而增强，在BSA浓度为4.0 μM时达到最大值（增强3.2倍），此过程伴随着组装诱导发射增强（AIEE）效应。组装后，纳米簇的绝对荧光量子产率从2.50%显著提高至7.78%。TEM显示，组装后纳米簇的平均粒径约为1.90 nm，核心结构得以保持，表明是形成了分散的BSA-纳米簇复合物，而非纳米簇的聚集。荧光寿命测量也证实组装后寿命从1.42 μs延长至1.89 μs，支持了AIEE效应和刚性化纳米结构形成的机制。

2.3. 基于Au-AgNCs@BSA组装体的CTC荧光检测

将Au-AgNCs@BSA组装体用于CTC检测时，随着CTC浓度增加，在420 nm处出现一个新的蓝色荧光发射峰（I₄₂₀），其强度逐渐增强，而纳米簇在687 nm处的原始红色发射（I₆₈₇）保持稳定。两种发射强度的比值（I₄₂₀/I₆₈₇）在0.10至15 μM的CTC浓度范围内呈现良好的线性关系，检测限为20 nM。在365 nm紫外灯下，溶液荧光颜色从微红色逐渐变为亮蓝色，实现了可视化或半定量分析。

2.4. 对CTC检测的选择性与抗干扰性能

传感器对CTC表现出卓越的选择性。测试了包括多种氨基酸、金属离子、阴离子在内的常见干扰物，以及其它三种四环素类抗生素（TC、OTC、DC），发现只有CTC能引起显著的比率荧光响应。即使将常见无机离子（如Na⁺、K⁺、Ca²⁺、Mg²⁺、Cl^-、CO₃^2-、NO₃^-）浓度提高至100 μM，也未观察到明显干扰。抗干扰实验进一步表明，在CTC存在下，上述干扰物的加入不会显著改变传感器的特异性响应。

2.5. 传感机制研究

自由CTC在约570 nm处仅有微弱的荧光发射。在Au-AgNCs@BSA组装体存在下，CTC的荧光在420 nm处被显著增强并蓝移。这直接证明，强荧光信号来源于CTC分子结合到BSA的疏水腔内后，其本征荧光在刚性化的微环境中被极大地增强。CTC与BSA的强相互作用（结合常数达5.74 × 10⁴M^-1）是特异性识别的基础，CTC分子通过多个氢键和疏水作用被包裹在BSA的疏水位点中。同时，CTC的加入并未改变Au-AgNCs的紫外-可见吸收光谱，且其687 nm处的荧光保持不变，表明CTC与BSA的结合位点不同于Au-AgNCs的结合位点，且两者间无荧光共振能量转移（FRET）发生。因此，传感机制为：BSA一方面通过AIEE效应增强Au-AgNCs的红色荧光，提供稳定的内参信号；另一方面特异性结合CTC，并大幅增强其本征蓝色荧光，从而构成比率型传感平台。

2.6. 实际应用：真实水样中CTC的检测

为评估传感器的实际应用性，将其用于加标的自来水和湖水（取自吉林大学前卫校区清湖）样品中CTC的检测。实验结果显示，相对标准偏差（RSD）均低于5%，加标回收率在98.6%至102.5%之间，表明该方法在复杂实际水环境中具有可靠性和准确性，在监测自然环境水体的抗生素残留方面具有强大潜力。

3. 结论

本研究成功构建了一种基于Au-AgNCs@BSA组装体的新型比率荧光传感平台，用于金霉素（CTC）的高选择性、高灵敏度检测。其核心创新在于BSA发挥了双重功能：通过AIEE效应增强纳米簇的红色荧光作为稳定内参，同时作为特异性宿主大幅增强CTC的本征蓝色荧光。该传感器能有效区分CTC与其它四环素类抗生素，线性检测范围宽（0.10–15 μM），检测限低（20 nM），并在真实水样检测中表现出良好的准确度与精密度。尽管目前检测需2小时平衡时间（源于BSA-CTC生物分子相互作用的动力学），这为未来通过蛋白质工程或复合结构优化以加速响应指明了方向。本工作不仅为环境CTC监测提供了一种有前景的工具，所采用的“单一蛋白实现信号增强与选择性识别”策略也为开发针对其他生物相关分子的比率型传感器提供了一个有潜力的设计蓝图。