优化大鼠体外受精技术以实现基于冻融精子的模型冷冻复苏

《Biology》：Optimizing Rat In Vitro Fertilization for Rat Model Cryo-Resuscitation from Frozen–Thawed Sperm Hongsheng Men, Payton S. Oswalt and Elizabeth C. Bryda

本文通过优化大鼠体外受精(IVF)操作流程，旨在建立一套可靠的方案，以替代卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)，用于从冷冻保存的精子中复苏大鼠模型。研究验证了IVF方案在限定工作日内（9小时）的可行性，并评估了不同品系大鼠（如SD、LE、F344）在超数排卵和卵母细胞成熟时间上的差异。尽管取得初步成果，但结果仍显示出品系/种群间的显著变异性，表明未来可能需要针对特定品系进行方案定制。

　　

优化大鼠体外受精用于基于冻融精子的模型冷冻复苏

大鼠是生物医学研究中一个多世纪以来的主要实验模型之一，因其与人类在遗传和生理上的相似性，在理解人类疾病机制、开发新疗法和治疗手段方面具有不可估量的价值。随着胚胎干细胞系的建立以及基因组编辑工具的发展，如锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应物核酸酶(TALEN)和规律间隔成簇短回文重复序列及其相关蛋白9(CRISPR/Cas9)，特别是CRISPR/Cas9系统的简便性和靶向特异性，使得创建大鼠模型的速度得以加快。

动物模型通常以冷冻种质（精子、胚胎或两者）的形式进行冷冻保存。对于具有单基因突变的商业化品系/种群背景的模型，通常采用冷冻精子保存，这种方法简单、成本效益高，且不需要大量动物。从冷冻精子中高效且经济地复苏动物模型的方法，对于生物医学界能够便捷地获取仅以冷冻精子形式保存的动物模型至关重要。大多数以冷冻精子形式保存的小鼠模型可以通过体外受精(IVF)有效复苏。然而，对于大鼠模型而言，情况并非如此，因为大鼠IVF缺乏一致性和可重复性。卵胞浆内单精子显微注射(ICSI)一直是美国大鼠资源与研究中心(RRRC)从冷冻精子复苏大鼠模型的唯一可靠方法。ICSI操作需要昂贵的设备和大量的技术培训。因此，优化大鼠IVF，并使其能够作为ICSI的一个可靠、经济的替代方案用于冷冻复苏，将对生物医学界产生巨大的益处。

近年来，大鼠精子冷冻和体外受精技术均取得了进展。然而，不同品系/种群之间，甚至同一品系的不同个体、以及同一只雄性大鼠的不同冷冻精子样本之间，仍然存在显著差异。此外，当前已发表的利用冻融精子进行IVF的方案，由于需要处理冷冻精子并进行精子受精前的获能孵育以及精子-卵母细胞共孵育，整个过程大约需要12小时。另外，卵母细胞的成熟对成功受精所需的卵母细胞调控事件至关重要。本研究旨在优化当前的IVF方案，使其能够作为ICSI的一种可靠、经济的替代方案，用于从冷冻精子复苏大鼠模型。研究具体考察了以下几点：（1）使用不同品系/种群冷冻精子进行IVF的总体效率；（2）修改冻融精子IVF操作步骤，使其能够在更符合典型工作日程的9小时内完成的可能性；（3）不同品系/种群在体内卵母细胞成熟时间上的差异，以期为优化特定品系/种群的超数排卵方案、改善IVF结果提供依据。

在材料与方法部分，研究使用了野生型Sprague Dawley (SD)、Fischer 344 (F344)和Long Evans (LE)大鼠。精子冷冻过程基本按照先前描述的方案进行，对成熟雄性大鼠附睾尾部的精子进行冷冻保存。精子在冷冻前会评估其运动能力和浓度，只有总运动力≥60%且浓度≥15 x 10⁶精子/毫升的样本才会被选用。冷冻完成后，将冻存管保存在液氮中。

体外受精操作在先前方案的基础上进行了调整。所使用的培养基是添加了40 mg/mL牛血清白蛋白(BSA)的改良人输卵管液(mHTF-40 mg/mL BSA)。对于每个IVF培养滴，使用一根冷冻精子吸管。解冻后的精子在mHTF-4 mg/mL BSA中进行“上浮”处理，之后洗涤并置于IVF培养滴中孵育，期间会移除死精团块。精子的获能时间（除去死精后）通常为90分钟。供体雌性（5周龄）通过腹腔注射孕马血清促性腺激素(PMSG)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)进行超数排卵。在精子获能过程结束后，处死供体雌鼠，迅速分离输卵管，并将卵丘-卵母细胞复合体(COC)释放到预孵育的IVF培养滴中。精子和COC在37°C、5% CO₂的孵箱中共培养8小时。

在胚胎培养和发育评估环节，推测的受精卵在针对大鼠优化的钾改良简单培养基(KSOM-R)中培养，并在24小时评估卵裂、120小时评估囊胚形成、144小时评估孵化情况，以评估其体外发育潜力。

研究结果首先考察了使用不同品系/种群冷冻精子进行IVF的一般效率。如表1所示，使用来自转基因和基因敲入大鼠的冻融精子进行IVF，SD和LE品系在卵裂率上存在差异，但囊胚率和孵化囊胚率无显著差异。

随后，研究探讨了对操作流程进行修改，使其能在典型工作日程内（9小时）完成的可能。标准的大鼠IVF流程大约需要12小时，超出了常规的实验室工作时间。研究试图通过缩短精子获能时间（从除去死精后的90分钟减至30分钟）以及缩短精子和COC共培养时间（从8小时减至6小时）来调整流程。然而，这种缩短时间的方法对于近交系F344雄性大鼠并不成功，卵母细胞在IVF后几乎没有卵裂。因此，研究将精子-卵母细胞共培养时间延长至21小时，这对一只受试F344雄性大鼠的精子IVF结果有所改善。调整后的流程步骤及相应时间框架总结在表2中。针对SD和F344大鼠修改IVF流程后获得的卵裂率和囊胚率如表3所示，两者结果相似。

研究还考察了卵母细胞成熟对IVF成功率的影响。研究发现，在使用相同超数排卵方案的情况下，LE大鼠卵母细胞的第一极体释放时间比SD和F344大鼠延迟了约2小时。图1展示了来自SD、F344、标准超数排卵方案的LE以及改良超数排卵方案的LE大鼠卵母细胞中第一极体的代表性图像。

图2则更直观地展示了SD、F344和LE大鼠在接受相同超数排卵方案后卵母细胞第一极体释放的时间分布。SD和F344的卵母细胞在上午10点左右达到释放峰值，而LE卵母细胞的释放峰值推迟了2小时。

为了探究LE大鼠的延迟，研究人员将LE大鼠的PMSG注射时间提前了2小时（约上午8:00）。结果显示，修改方案后，LE卵母细胞的第一极体释放情况得到改善，峰值时间也提前了1小时，如图3所示。

尽管观察到了LE大鼠卵母细胞成熟时间的差异，并通过调整PMSG注射时间改变了其第一极体释放模式，但后续的IVF实验表明，使用修改后的超数排卵方案并未能显著改善LE大鼠的IVF结果。如表4所示，标准方案与修改方案在卵裂率、囊胚率和孵化率上均无显著差异。

在讨论部分，研究总结了主要发现。通过减少死精移除后的精子预孵育时间（从90分钟减至30分钟），并将精子与COC共培养时间调整为6小时（SD）或延长至21小时（F344），研究成功地将针对不同品系/种群的IVF流程定制化，使其能够在一个常规的9小时工作日内完成。研究证实了LE大鼠与SD、F344大鼠相比，在接受相同超数排卵方案时，其第一极体释放存在2小时的延迟。然而，为LE大鼠设计的、将PMSG和hCG给药间隔延长2小时的改良超数排卵方案，并未能显著改善IVF结果。这表明，除了成熟时间外，可能还有其他影响LE品系IVF结果的生物学因素。

综上所述，本研究通过对现有IVF方案进行一些修改，实现了大鼠IVF技术的渐进式改进。鉴于当前方案固有的变异性水平，仍需要更多的优化工作，研究人员必须认识到，最终可能需要针对个体品系/种群开发特定的操作方案。不过，我们对于未来能够更常规地使用IVF配合冻融大鼠精子进行模型冷冻复苏抱持乐观态度。一旦实现这一目标，未来的目标将是常规使用大鼠IVF进行冷冻保存大鼠品系的复苏，而仅将ICSI作为在IVF多次失败情况下的备用方案。