《Biology》：Root Fungal Endophyte Communities Differ Among Plant Functional Groups in an Alpine Meadow
Miao Dong and
Shucun Sun
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本文研究了青藏高原高山草甸中45种植物的根内真菌（RFE）群落。研究发现，不同植物功能群（PFG）（禾草、豆科、双子叶杂草、单子叶杂草）拥有独特的RFE群落，特别是传统分类中被归为一类的单/双子叶杂草RFE群落差异显著。豆科植物比禾草拥有更多共生型真菌。根系氮浓度是塑造RFE群落最强的预测因子，其次为根长、根生物量和物种多度。这揭示了植物功能性状与多度如何塑造地下微生物伙伴关系，强调在研究脆弱高山环境中的植物多样性与生态系统韧性时，必须考虑微生物。
1. 引言
根内真菌（RFE）是一类定殖于植物根组织内部、通常不引起明显病害症状的真菌，在陆地生态系统中扮演重要角色。它们能通过促进氮、磷获取，增强宿主对生物胁迫（如病原体、植食动物）和非生物胁迫（如干旱、渗透胁迫）的抗性，进而提高宿主植物的适应性。此外，RFE还能在群落水平上影响物种共存与多样性，以及生态系统初级生产力和养分循环。
越来越多的研究表明，宿主植物身份可显著塑造RFE的群落结构和物种组成。然而，这些研究大多聚焦于个体植物间的RFE差异，对更广泛的生态分组——如植物功能群（PFG）——的关注有限。植物功能群是基于相似生态功能而非系统发育关系的物种集合，常被用于简化复杂的植物群落。探究跨植物功能群的RFE群落，可为理解植物-微生物相互作用的普遍性及植物群落构建提供新见解。
植物性状是植物功能群分类的关键指标，已被证明与RFE群落的结构和物种组成密切相关。例如，高氮水平和碳水化合物含量与黑麦草中真菌内生菌浓度呈负相关，而脱落酸与拟南芥根上互惠真菌印度梨形孢的定殖潜力呈正相关。根深也被发现影响沙地中三种宿主植物的RFE组成和定殖。重要的是，尽管并非直接针对RFE，有报道称在温带草原的八种植物中，双子叶杂草比禾草拥有更多样化的丛枝菌根真菌（AMF）群落；而在荷兰的一片恢复草地中，植物功能群类型被确定为八种宿主植物间腐生真菌群落组成的主要驱动因子。这些差异被认为源于不同植物功能群在根系性状、碳分配策略和分泌物谱方面的变异。因此，我们有理由假设，RFE群落的物种组成和结构在不同植物功能群间存在差异。
本研究在青藏高原的高山草甸，调查了代表四个功能群（禾草、豆科、双子叶杂草、单子叶杂草）的45种植物及其根系功能性状（包括根长、根生物量、根含水量、根氮浓度和根碳氮比）的RFE。高山草甸具有丰富的植物物种多样性和功能多样性，是检验上述假想的理想系统。本研究旨在检验：（1）RFE的群落组成和结构是否在植物功能群间存在差异；（2）宿主功能性状是否能解释RFE群落在功能群间的变异。此外，根据“常见宿主假说”，该假说认为植物种群必须足够丰富，才能让被动传播的内生菌可靠地重新定殖并进化出宿主特异性，因此丰富的植物物种往往比低多度物种拥有更高的内生菌物种丰富度和多度。因此，我们进一步探讨（3）物种多度是否能显著解释植物功能群间RFE的变异。
2. 材料与方法
2.1. 研究地点
研究地点位于青藏高原东部的四川省红原县一处高山草甸。该地海拔约3500米。年均温1.7°C，月均温范围从1月的-9.3°C到7月的11.1°C。年均降水量756毫米，但年际变化大，80%以上集中在5月至9月。草甸在非生长季通常由牦牛放牧。植物多样性高，每平方米25-30种，植被覆盖度超过90%。植物群落以杂草、禾草和豆科植物为主。
2.2. 根系性状与物种多度
于2020年7月中旬（成熟生长期）随机采集了45种植物的根系。物种鉴定依据《中国植物志》。对于每个物种，在100×150米的草地样地内采用挖掘法采集五个个体。采样物种被分为四个功能群：禾草（G；6种）、豆科（L；4种）、双子叶杂草（DF；32种）和单子叶杂草（MF；3种）。采样时，用草皮铲挖掘大土块以保存根系完整性。将每株植物的地下部分连同周围土块浸入水中数小时，然后用低压水连续冲洗以去除附着土壤，从而获得完整根系。根长用直尺测量，为土壤表面到最深根尖的距离。冲洗后，用吸水纸轻轻吸干根系表面多余水分，称量鲜重。随后将根在75°C下烘干48小时并称重以确定根生物量。称重后，用元素分析仪测量碳（C）和氮（N）浓度。此外，根据烘干后鲜重损失百分比计算含水量。
另外，采用样方抽样法调查了植物群落的多度和组成。基于植被调查数据，本研究对45种植物进行了取样，代表了该地点近80%的总物种丰富度，因而充分捕捉了当地植物群落的组成。
2.3. 根内真菌
每个植物物种准备三个生物学重复用于微生物总基因组DNA提取。每个重复由大约0.8克新鲜根组成，随机采集自五个健康的、无可见病害症状的个体。这些个体与用于根系性状测量的个体不同，但来自同一草地区域。
对于每个重复，根样品依次用75%乙醇浸泡2分钟、0.5%次氯酸钠（NaClO）处理10分钟进行表面灭菌，随后用无菌水冲洗三次。使用天根植物DNA试剂盒按照制造商说明提取总基因组DNA。DNA提取后进行聚合酶链式反应（PCR）。选择真菌引物ITS4-Fun和gITS7F扩增包含内部转录间隔区区域的核糖体DNA（rDNA）。所有引物由生物伯特生物技术有限公司合成。反应在25μL混合物中进行。PCR扩增程序包括：94°C初始变性5分钟；随后94°C 30秒、56°C 30秒、68°C 45秒，共34个循环；最后72°C延伸10分钟。
使用TruSeq DNA PCR-Free样本制备试剂盒构建测序文库。扩增子测序在Illumina MiSeq台式测序仪上进行，采用双端2×250 bp配置，由生物伯特生物技术有限公司完成。内生真菌ITS序列在97%序列相似性阈值下使用QIIME v1.9.1聚类为操作分类单元（OTU）。为考虑样本间测序深度差异，所有样本均被稀释至观察到的最小测序深度。使用≥97%相似性阈值，对照UNITE数据库（8.0版）进行分类学分配。使用FUNGuild v1.1为OTU分配功能信息。
2.4. RFE的标志OTU
我们使用每个OTU的特异性和占有率来筛选每个植物功能群的标志OTU。根据Dufrene和Legendre的描述，特异性定义为OTU在植物功能群样本中的平均多度，占有率定义为OTU在植物功能群样本中出现的相对频率。根据Gweon等人的方法，特异性和占有率大于或等于0.7的OTU被筛选为各植物功能群的标志OTU。
2.5. 统计分析
使用R包vegan v. 2.5-4中的‘diversity’函数计算OTU丰富度和香农多样性指数。使用广义线性模型（GLM）评估植物功能群间RFE丰富度和香农多样性的差异。丰富度用泊松分布和对数连接函数建模，香农多样性用高斯分布和恒等连接函数分析。所有模型均使用R包vegan v. 2.5-4中的‘glm’函数拟合。基于Bray–Curtis距离的RFE群落β多样性通过主坐标分析（PCoA）可视化。使用R包pairwiseAdonis v. 0.4中的‘pairwise.adonis2’函数，通过成对置换多变量方差分析（PERMANOVA）进一步检验功能群间群落组成的差异。
使用R包vegan v. 2.5-4中的‘vegdist’函数计算不同功能群物种间LFE群落的Bray–Curtis距离、每个根系功能性状的欧几里得距离以及植物多度。然后构建随机森林模型，以评估根系功能性状和植物多度对跨功能群RFE群落组成的相对影响。使用R包randomForest v. 4.6-14中的‘randomForest’函数构建模型，并使用R包rfPermute v. 2.5.1中的‘rfPermute’函数评估预测变量的显著性。
同样使用PCoA检查标志OTU组成的功能变异。功能群间差异的统计显著性通过成对PERMANOVA评估。
3. 结果
3.1. 不同植物功能群间真菌群落组成的差异
共获得195,893条高质量序列，聚类为2924个内生真菌OTU。其中，豆科有635个OTU，禾草989个，双子叶杂草2678个，单子叶杂草401个。RFE的OTU丰富度在双子叶和单子叶杂草间差异显著，但在其他功能群间无显著差异。此外，所有功能群间RFE的香农多样性无显著差异。
成对PERMANOVA分析表明，RFE组成在双子叶杂草与禾草、双子叶杂草与单子叶杂草、以及单子叶杂草与禾草之间存在显著差异。然而，豆科与其他三个功能群之间未检测到显著差异。子囊菌门是所有功能群中的优势门，但其相对多度在单子叶杂草（38.9%）中明显低于双子叶杂草（72.4%）、禾草（54.3%）和豆科（66.8%）。毛霉门在禾草、豆科和双子叶杂草中的比例高于单子叶杂草。在单子叶杂草中，担子菌门和“其他”类别分别占很大比例，超过它们在其他功能群中的占比。
3.2. 影响植物功能群间RFE群落的因素
氮浓度的变异是影响不同植物功能群间RFE群落组成变化的最显著因素。此外，根长和根生物量的差异也促进了不同功能群间RFE群落的组成变异。除了根系功能性状，植物多度的变异也对RFE群落的组成变化产生了显著影响。相比之下，碳氮比和含水量的变异对功能群间RFE群落内部组成变化的影响在统计学上不显著。
3.3. 不同植物功能群间标志OTU的差异
所有植物功能群内的RFE在占有率和特异性值方面表现出相当大的变异。基于这些值，我们在四个功能群中鉴定出27个标志OTU。这些标志OTU的数量在功能群间不同，显示出丰富度增加的趋势：单子叶杂草（2个）、豆科（4个）、双子叶杂草（5个）、禾草（7个）。这些标志OTU分别占总序列的4.5%、35.8%、21.7%和6.6%。子囊菌门在四个功能群的标志OTU中均有出现。与禾草、豆科和单子叶杂草相关的标志OTU还分别包括被孢霉门、毛霉门和担子菌门的代表。
成对PERMANOVA分析表明，植物功能群间标志OTU的功能组成在双子叶杂草与禾草、双子叶杂草与豆科、禾草与豆科、以及禾草与单子叶杂草之间存在显著差异。然而，双子叶杂草与单子叶杂草之间、以及豆科与单子叶杂草之间未检测到显著差异。此外，豆科中标志OTU的共生营养模式比例高于其他三个功能群，而双子叶杂草和豆科中标志OTU的病原营养模式比例也高于其他两组。禾草中具有三重营养模式的标志OTU比例高于其他三个功能群。
4. 讨论
我们的研究结果表明，高山草甸中RFE群落的组成在不同植物功能群间存在差异。这种变异在很大程度上可以由物种多度和根系功能性状（包括氮浓度、根长和根生物量）来解释，从而支持了我们的假说。这些结果表明，植物功能群有潜力作为区分RFE群落组成的可靠指标，尽管存在某些不一致之处。
在本研究中，RFE群落的OTU丰富度在不同功能群间变化很大。子囊菌门在禾草、豆科和双子叶杂草的RFE群落中占主导地位，这与其在高山土壤中的广泛分布一致。由于大多数RFE来源于土壤微生物组，土壤中子囊菌门的高多度可能促进了它们对植物根的定殖。这些发现与先前对蒙古黄芪和沙漠灌木的研究一致。我们的结果进一步表明，即使植物共享一个共同的环境真菌库，不同的植物功能群也会选择性地招募不同的RFE子集，突出了宿主介导的选择在塑造功能微生物多样性中的重要性。这种差异性的招募可能由根系分泌物成分（如独脚金内酯、类黄酮和香豆素）的变异以及涉及植物激素（如水杨酸和乙烯）差异产生的植物免疫反应所驱动。
值得注意的是，单子叶杂草的RFE群落组成与其他功能群相比存在显著差异。例如，毛霉门在单子叶杂草中很少见，而在其他功能群中则更为常见。这种模式可能部分反映了毛霉门的定殖策略，它们通常通过菌丝网络或接触真菌残体侵入植物根。由于单子叶杂草在群落中丰度较低，它们可能建立广泛菌丝网络或遇到真菌残体的机会较少，从而限制了毛霉门的定殖。相比之下，担子菌门的相对多度在单子叶杂草中远高于其他三个功能群。这种差异可能与观察到的单子叶杂草较高的根含水量有关，这可能为需要较高湿度水平的担子菌门创造了有利的微环境。此外，单子叶杂草通常表现出延长的生长期或多年生生活史，可能为生长缓慢的担子菌门提供了足够的时间来完成定殖和传播过程。单子叶杂草独特的生活史特征及其相关的RFE群落组成表明，这些植物在恶劣环境条件下稳定植物群落构建方面可能具有重要作用。然而，需要指出的是，由于本地物种库的限制，本研究中单子叶杂草仅包含3个植物物种，有限的代表数量意味着这一趋势仍是初步的，需要在未来具有更广泛分类覆盖范围的研究中加以证实。
根系功能性状和植物多度共同导致了植物功能群间RFE群落组成的显著变异。在这些性状中，根氮浓度成为最具影响力的预测因子，占随机森林模型解释方差的28.2%，从而证实了先前研究的发现。根长和根生物量也在塑造RFE群落组成中扮演重要角色。更深的根系可以接触到更深的土壤层，并增加与周围土壤的接触范围。由于土壤是RFE的主要来源，根系更深的植物可能为土壤来源的真菌定殖根组织提供更多机会。与根长类似，更大的根生物量为真菌定殖提供了更多的物理空间和生态位可用性。这种扩展的栖息地通过提供更多的侵染位点和表面积来支持更大的真菌多样性和多度。我们的研究结果与来自中国热带森林、瑞典苔原和英国草地的研究一致，这些研究中根生物量显著影响了根相关真菌群落组成。总之，我们的结果表明，根系投资更大的植物不仅增强了其资源获取能力，而且还拥有更丰富的内生真菌群落，从而提高了胁迫耐受性和生产力。
除了植物功能性状，植物多度显著影响功能群间RFE群落的变异。与常见宿主假说一致，更高的宿主多度可以增强宿主适应性RFE的建立和增殖，因为宿主-真菌相遇更频繁。同样，病原体多度通常随着其宿主植物的流行而增加。植物多度的增加也可能加剧种内竞争，减少分配给防御机制的资源，从而促进真菌定殖。此外，双子叶和单子叶杂草间植物多度的显著差异可能部分解释了两组之间观察到的RFE丰富度差异。
标志OTU对特定的植物功能群表现出很强的特异性，同时在各功能群内的所有地点一致出现。标志OTU的组成在不同植物功能群间存在差异，反映了与病原、共生和腐生营养模式相关的类群相对多度的不同。
表现出共生生活方式的OTU比例在豆科中显著高于其他三个功能群。这种模式与先前证明豆科与微生物之间存在密切共生关系的研究一致。豆科中的共生OTU以芬兰鞘孢为主，它可以产生碱性磷酸酶、酯酶、酯酶脂肪酶和酸性磷酸酶，从而促进宿主对磷和其他养分的吸收。在禾草中，具有多重营养模式的标志OTU包括木霉和被孢霉，两者都具有强大的抑制植物病原真菌的功能潜力。此外，被孢霉可以产生酸性磷酸酶，增强宿主的磷获取。研究表明，研究区域的植物生长受到磷限制，因此禾草和豆科都可能通过不同的标志真菌物种来缓解磷胁迫。来自不同功能群的植物招募分类学上不同但功能相似的根内真菌来满足其生理需求，从而减少对相同微生物资源的直接竞争，同时维持群落水平的功能输出，最终促进种间协调和物种共存。
与其他三个功能群相比，双子叶杂草中具有病原营养模式的标志OTU比例显著更高。这种模式可能归因于它们较高的相对物种多度，而这通常与病原真菌的出现呈正相关。重要的是，尽管在双子叶杂草、禾草和豆科中存在表现出严格病原性或潜在病原性营养模式的标志OTU，宿主植物并不一定表现出可见的病害症状。据推测，植物的潜伏RFE被认为是从病原真菌进化而来，与强致病力病原体关系密切，但它们通过延长潜伏期表现出有限的致病作用。在单子叶杂草中，标志OTU包括Lachnum，它已被证明能显著促进越橘的根系生长，从而增强宿主在高山环境中的生存能力。
5. 结论
总之，本研究表明，高山草甸中根内真菌（RFE）群落的组成在不同植物功能群间存在显著差异。通常由物种性状、生活史策略或生态响应定义的植物功能群，不仅通过植物特征来区分，还通过其相关的RFE群落来区分。重要的是，我们检测到单子叶和双子叶杂草间RFE组成存在明显差异，这对传统分类中常将它们归为同一功能组的做法提出了挑战。此外，我们表明根系功能性状和物种多度部分解释了观察到的RFE组成变异，这表明RFE群落构建与植物功能策略密切相关。由于不同的RFE或OTU为其宿主提供不同的生态功能，这种分化可能增强了植物群落适应环境变化的能力。然而，我们的研究主要聚焦于RFE群落的分类学组成，仅基于FUNGuild数据库对其宿主植物的潜在功能进行了初步注释。未来的研究应整合受控实验与多组学方法，以阐明关键RFE类群的功能作用及其对环境胁迫的响应机制。
