《Biology》：Genetic Activation of Locus Coeruleus Noradrenergic Neurons Modulates Cerebellar MF-GrC Synaptic Plasticity via Presynaptic α2-AR/PKA Signaling in Mice
Ying-Han Xu,
Xu-Dong Zhang,
Yang Liu,
Zhi-Zhi Zhao,
Yuan Zheng,
De-Lai Qiu and
Chun-Ping Chu
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本研究揭示了蓝斑（LC）去甲肾上腺素能神经元通过其轴突投射至小脑皮层，在完整动物体内调控小脑苔藓纤维-颗粒细胞（MF-GrC）长时程突触可塑性的关键机制。研究综合运用光遗传、化学遗传、在体电生理及纤维光度测量等技术，首次阐明LC神经元激活可通过激活α2A-肾上腺素能受体（α2A-AR）/蛋白激酶A（PKA）信号级联反应，诱导突触前长时程抑制（LTD），从而抑制面部刺激诱导的MF-GrC长时程增强（LTP），为理解去甲肾上腺素在感觉运动整合与学习记忆中的作用提供了新证据。
引言
在小脑中，苔藓纤维（MFs）是向小脑皮层的主要兴奋性谷氨酸能输入。MFs的膨体体积大，包含多个活动区，并与数十个颗粒细胞（GrC）形成突触。每个MF膨体及其靶向的GrC树突被包裹在称为小球的特化结构内的胶质细胞中。通过MFs传输的感觉信息诱导谷氨酸释放，从而在GrCs中引发兴奋性突触后电流（EPSCs），并在MF-GrC突触处引发长时程突触可塑性。MF-GrC长时程可塑性在小脑适应来自原生MFs的兴奋性输入中发挥着关键作用，也被认为是大脑中运动学习和记忆的主要细胞基质。
去甲肾上腺素（NA）是对认知、警觉和注意力至关重要的神经调质。随着蓝斑（LC）神经元对小脑单胺能支配的发现，小脑已成为“点对点”和“全局”神经回路汇聚的结构；单胺类物质可通过直接的突触传递和旁分泌信号对神经元产生广泛影响。解剖学研究表明，源自LC的去甲肾上腺素能纤维通过多层纤维束投射到小脑皮层，并通过不同的肾上腺素能受体（ARs）亚型支配分子层、颗粒层和浦肯野细胞层。其中，α2A-AR在小脑皮层颗粒层（GL）中大量表达。越来越多的证据表明，LC去甲肾上腺素能神经元通过不同的AR亚型调节小脑神经元回路内的突触功能，然而，LC去甲肾上腺素能神经元调节面部刺激诱发的MF-GrC突触长时程可塑性的机制尚不清楚。本研究旨在探究DBH-Cre小鼠中，光遗传或化学遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元调节小脑MF-GrC突触面部刺激诱发的长时程突触可塑性的机制。
材料与方法
本研究使用了DBH-Cre转基因小鼠。通过立体定位注射，将携带光敏感通道蛋白（hChR2）或化学遗传学受体（hM3Dq）的Cre依赖性腺相关病毒（AAV）特异性递送至LC的去甲肾上腺素能神经元。同时，将谷氨酸传感器病毒（iGluSnFR.A184S）注射至小脑皮层Crus II区，用于监测谷氨酸释放。实验方法包括在体局部场电位记录、纤维光度测量、离体脑片膜片钳记录以及免疫荧光染色。通过向同侧触须垫施加气流（空气喷吹）进行面部刺激，诱导MF-GrC突触反应。利用蓝光（470 nm）对LC进行光遗传学激活，或通过在小脑表面灌流氯氮平-N-氧化物（CNO）实现化学遗传学激活。使用包括α2-AR拮抗剂（育亨宾，YHB；BRL44408）、NMDA受体拮抗剂（D-APV）、PKA抑制剂（KT5720）和PKC抑制剂（白屈菜赤碱，Chelerythrine）在内的多种药物来探究相关信号通路。
结果
1. 光遗传与化学遗传病毒在LC去甲肾上腺素能神经元中的表达
立体定位注射验证了AAV-DIO-hChR2(H134R)-mCherry和AAV-DIO-hM3D(Gq)-mCherry在小鼠LC多巴胺β-羟化酶（DBH）阳性神经元（即去甲肾上腺素能神经元）中的特异性表达。离体膜片钳记录证实，光刺激可显著增加LC神经元的放电频率。免疫荧光结果显示，hChR2在LC和小脑颗粒层（GL）中均有表达，呈现散在的点状分布，表明LC去甲肾上腺素能神经元表达功能性hChR2并将其轴突投射至小脑GL。
2. 光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元抑制面部刺激诱导的小脑MF-GrC LTP
在GABAA受体被阻断的条件下，20 Hz面部刺激在对照组中成功诱导了MF-GrC LTP。然而，当20 Hz面部刺激与LC的光遗传激活（5 Hz， 60个脉冲）配对时，MF-GrC LTP被完全抑制，刺激后的反应幅度和曲线下面积（AUC）与基线相比无显著差异。该抑制效应可被α2-AR拮抗剂育亨宾所阻断，表明光遗传激活LC神经元通过α2-ARs抑制了面部刺激诱导的MF-GrC LTP。
3. 化学遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元损害面部刺激诱导的谷氨酸荧光LTP
利用iGluSnFR.A184S传感器，研究证实空气喷吹刺激可在小脑GL中诱发出谷氨酸荧光信号，并且20 Hz面部刺激可诱导谷氨酸释放的长时程增强（glu-LTP）。然而，通过灌流CNO化学遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元，则完全阻断了20 Hz面部刺激诱导的glu-LTP。这提示去甲肾上腺素能信号的上调通过抑制MF末梢的谷氨酸释放来损害MF-GrC LTP。
4. NMDA受体阻断下，光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元通过α2A-ARs触发MF-GrC LTD
由于20 Hz面部刺激诱导的MF-GrC LTP依赖于NMDA受体活性，研究者在阻断NMDA受体（应用D-APV）的条件下，观察LC激活对可塑性的影响。结果发现，在NMDA受体被阻断后，单独给予20 Hz面部刺激不能诱导LTP，但与LC光遗传激活配对时，却能诱导出MF-GrC LTD。该LTD伴随着配对脉冲比率（PPR）的显著增加，提示这是一种突触前形式的LTD。此LTD可被α2-AR拮抗剂育亨宾或选择性α2A-AR拮抗剂BRL44408所阻断，表明LC激活是通过α2A-ARs触发MF-GrC LTD。
5. 光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元通过PKA信号通路触发MF-GrC LTD
信号通路研究显示，PKA抑制剂KT5720能够完全阻止LC激活所触发的MF-GrC LTD，而PKC抑制剂白屈菜赤碱则无此效应。这表明光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元是通过α2A-AR/PKA信号级联通路，而非PKC通路，来调节MF-GrC突触传递和长时程可塑性。
6. α2A-AR在小脑颗粒层的表达
免疫荧光染色结果显示，α2A-AR在小鼠小脑皮层GL中大量表达，尤其在小球结构中富集。谷氨酸传感器iGluSnFR主要分布在颗粒细胞的突触后结构，而α2A-AR与iGluSnFR信号几乎没有共定位，进一步支持了α2A-AR主要位于MF末梢（突触前）的观点，这与其介导突触前LTD的功能一致。
讨论
本研究证明，20 Hz面部感觉刺激在小鼠小脑皮层诱导MF-GrC突触传递的LTP，而该效应可被LC去甲肾上腺素能神经元的光遗传激活通过α2A-ARs完全阻止。同样，面部刺激诱导的颗粒层glu-LTP也可被LC的化学遗传激活所消除。在NMDA受体被阻断的情况下，光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元通过激活α2A-ARs并依赖PKA信号级联，触发面部刺激诱导的MF-GrC LTD。这些结果表明，光遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元通过α2A-AR/PKA信号级联触发突触前LTD，从而抑制了面部刺激诱导的MF-GrC LTP。
从生理意义上看，小脑回路的长时程突触可塑性被认为是小脑运动学习和记忆的细胞机制。LC来源的去甲肾上腺素能纤维通过多层纤维束投射到小脑皮层，在调节感觉信息处理、运动协调和运动学习等生理过程中发挥重要的调制作用。本研究揭示的LC激活通过α2A-ARs触发新型MF-GrC LTD的机制，表明LC来源的去甲肾上腺素能传入通过激活突触前α2A-ARs，参与调节小脑皮层的MF-GrC突触可塑性，进而可能影响运动学习。这为理解在体条件下，LC来源的去甲肾上腺素能传入如何调制小脑皮层回路内的突触可塑性提供了新的证据。
研究的局限性与未来方向
本研究的在体实验在乌拉坦麻醉下进行。尽管乌拉坦已被广泛应用于神经调制系统研究，但它可能抑制LC去甲肾上腺素能神经元的化学遗传或光遗传激活，从而削弱其对MF-GrC突触传递和可塑性的调制作用。因此，未来有必要在清醒、非麻醉的小鼠中研究LC激活对小脑MF-GrC突触传递以及小脑依赖性学习或运动适应的调节作用。此外，本实验局限于小脑皮层Crus II叶和触须垫诱发的感觉输入。考虑到小脑小叶的解剖和功能异质性，以及LC投射密度和神经调制影响的区域差异，未来需要研究类似的机制是否在其他小脑小叶或感觉模式（例如肢体刺激诱发的感觉输入）中起作用。
结论
本研究表明，LC去甲肾上腺素能神经元的光遗传激活通过α2A-ARs触发MF-GrC LTD，并损害NMDA受体依赖的LTP。化学遗传激活LC去甲肾上腺素能神经元则完全消除了面部刺激诱导的MF-GrC glu-LTP。α2A-AR在小脑皮层GL，尤其是在MF-GrC突触前末梢的小球结构中大量表达。PKA抑制可完全阻止LC激活触发的MF-GrC LTD，而PKC抑制则无效。这些发现综合表明，LC去甲肾上腺素能神经元的激活通过α2A-AR/PKA信号级联通路，抑制MF末梢的谷氨酸释放，从而触发突触前LTD并损害LTP。本研究为LC来源的去甲肾上腺素能传入在完整动物体内调节小脑皮层回路内（特别是MF-GrC）突触可塑性提供了新颖的证据。
