一种基于ClC3离子交换体的蠕虫状核酸纳米结构：用于基因递送与内体逃逸的新策略

《SCIENCE ADVANCES》：A worm-like nucleic acid nanostructure for gene delivery and endosomal escape via ClC3 ion exchanger

为解决基因治疗中纳米载体因内体滞留导致递送效率低下的瓶颈问题，研究人员构建了一种三维蠕虫状核酸纳米结构（Au@PDA@oligonucleotide NW）。该结构通过其独特的蠕虫形状自然激活内体中的氯离子电压门控通道3（ClC3）离子交换体，介导H+和Cl?积累，最终引发内体膜破裂，实现高效的胞质释放。该研究在体外、离体和体内模型中均展示了优异的基因调控与治疗潜力，为安全高效的基因治疗提供了新平台。

基因治疗被誉为现代医学的革命性方向，其核心挑战之一是如何将治疗性核酸（如DNA、siRNA、miRNA、mRNA）安全、高效地递送到目标细胞的细胞质中。虽然纳米颗粒（NPs）作为基因载体相比病毒载体免疫原性更低，但绝大多数纳米颗粒在进入细胞后会被困在内体-溶酶体系统中，无法有效逃逸到胞质发挥作用，这成为基因递送领域长期存在的“瓶颈”。传统的解决方案主要依赖阳离子纳米颗粒的“质子海绵效应”或脂质纳米颗粒的“膜 destabilization”，但这些方法常伴随细胞毒性、脂质筛选困难或引发炎症反应等问题。因此，开发一种无需阳离子/脂质基团、无机械刺激且能天然高效逃逸内体的新型基因载体，是领域内亟待突破的难题。

发表在《SCIENCE ADVANCES》上的这项研究，提出了一种创新的解决方案：一种三维蠕虫状核酸纳米结构。研究人员将治疗性核酸吸附在金-聚多巴胺纳米蠕虫（Au@PDA NW）模板上，构建了Au@PDA@oligonucleotide NW。令人惊讶的是，这种带负电、不含任何阳离子或脂质基团的纳米结构，仅凭其蠕虫状的形态，就能自然激活内体膜上的氯离子电压门控通道3（ClC3）离子交换体。ClC3的激活导致内体中H⁺和Cl^?离子积累，渗透压升高，最终引起内体膜破裂，实现核酸货物的胞质释放。该纳米结构在多种细胞类型中均表现出卓越的内体逃逸效率（与内体的皮尔逊相关系数PCC <0.2），并在体外基因调控、离体细胞疗法和体内疾病治疗模型中展现出优于商用转染试剂Lipofectamine的效果。

为开展这项研究，作者运用了几个关键的技术方法：首先，他们通过声化学法合成了金-聚多巴胺核壳纳米蠕虫（Au@PDA NW）作为模板。其次，利用透射电子显微镜（TEM）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）对纳米结构进行表征和细胞运输定量。第三，采用共聚焦显微镜进行时间推移成像和免疫荧光染色，追踪纳米结构在细胞内的运输轨迹及与不同细胞器（如早期内体、晚期内体、溶酶体）的共定位情况。第四，通过全转录组测序（RNA-seq）和蛋白质印迹（Western blot）分析了纳米结构处理引起的基因和蛋白表达变化。第五，利用小鼠疾病模型（单侧输尿管梗阻UUO模型和乙酰氨基酚APAP诱导的急性肝损伤ALI模型）评估了纳米结构在离体和体内治疗中的疗效。

研究结果

Preparation of a worm-like nucleic acid nanostructure

研究人员首先合成了Au@PDA NW模板，并通过静电吸附将非编码寡核苷酸T₂₁或A₂₁负载其上，形成Au@PDA@T₂₁NW。该结构长约224 nm，带负电荷（-37.8 mV），稳定性好，且无细胞毒性。细胞摄取机制研究表明，巨胞饮是其主要的进入途径。

Endosomal escape of oligonucleotide-adsorbed NWs

时间推移共聚焦成像显示，Au@PDA@T₂₁NW在孵育8小时后开始从酸性囊泡中逃逸。在不同细胞系（A549、bEnd.3、BMDMs、hMSCs）中，孵育24小时后，纳米结构与酸性囊泡的共定位程度很低（PCC ~0.1-0.2），显著低于商用转染载体（Lipo、PEI、LNP）。透射电镜图像直接观察到了细胞质中游离的纳米结构，证实了其内体逃逸能力。相比之下，球形对照颗粒Au@PDA@T₂₁NP则大部分滞留于内体中。

Role of ClC3in endosomal escape

研究表明，纳米结构的内体逃逸不依赖于“质子海绵效应”。RNA-seq分析发现，用NW处理的细胞中，ClC3基因表达显著上调。蛋白质印迹和免疫荧光证实了ClC3蛋白在晚期内体/溶酶体中的表达增加。功能实验证明，用siRNA敲低ClC3会严重破坏NW的内体逃逸，而用药物bufalin激活ClC3则会加速逃逸过程。这确立了ClC3离子交换体在NW介导的内体逃逸中的核心作用。

Ionic accumulation and endosomal membrane rupture

研究人员使用荧光探针MQAE和比率成像染料，证明了在NW存在的囊泡内，Cl^?和H⁺的浓度显著升高，而这一过程依赖于ClC3。这种离子积累导致囊泡内渗透压升高。通过表达Gal8-GFP（一种内体膜破裂标记物）和透射电镜观察，直接捕捉到了NW引发的内体膜破裂现象，以及纳米结构从破裂膜处逃逸至细胞质的瞬间。

In vitro delivery of diverse oligonucleotides to various cell types

该纳米结构成功递送了多种核酸药物并实现了功能效应：1）递送反义DNA（asEGFP）至bEnd.3细胞，有效抑制了EGFP表达；2）递送miR-223至M1型巨噬细胞，成功将其复极为M2型；3）递送siNog（针对Noggin的siRNA）至人间充质干细胞（hMSCs），有效促进了其成骨分化。在所有应用中，NW的表现均优于或等同于Lipofectamine，且细胞毒性更低。

Preparation of mRNA-adsorbed NWs

为实现mRNA递送，研究者在Au@PDA NW表面包裹了一层由阳离子脂质（DOTAP）、中性脂质（DOPE）和胆固醇组成的中间涂层，再吸附mRNA，形成了Au@PDA@mRNA NW。该结构同样能高效进入细胞并逃逸内体，并在hMSCs中实现高转染效率。

Ex vivo mRNA delivery to hMSCs for reducing kidney fibrosis

研究利用NW将编码CXCR4（归巢受体）和BMP7（抗纤维化蛋白）的mRNA转染至hMSCs，然后将工程化细胞注射到单侧输尿管梗阻（UUO）模型小鼠体内。结果显示，NW转染的hMSCs能更有效地归巢至纤维化肾脏，并显著提升BMP7表达，同时抑制胶原蛋白I（Col-I）和α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA）等纤维化标志物，减轻了肾脏纤维化。

In vivo mRNA delivery to hepatocytes for reducing liver injury

直接将负载肝细胞生长因子（HGF） mRNA的NW静脉注射至乙酰氨基酚（APAP）诱导的急性肝损伤（ALI）小鼠体内。NW能有效靶向肝脏，在肝细胞中实现HGF表达，并通过ClC3依赖途径逃逸内体。治疗显著减少了肝脏坏死区域和凋亡细胞，降低了血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）水平，有效缓解了肝损伤。

研究结论与讨论

本研究成功开发了一种具有固有内体逃逸机制的三维蠕虫状核酸纳米结构。其核心创新点在于，无需引入阳离子、脂质或细胞穿膜肽，仅凭其独特的蠕虫形状，便能自然激活内体膜上的ClC3离子交换体。ClC3的激活导致囊泡内Cl^?和H⁺积累，渗透压改变，最终引发内体膜破裂，实现高效的基因递送。

该研究的重大意义在于：

1. 1.
   机制创新：首次揭示并验证了ClC3离子交换体作为纳米载体内体逃逸关键介导者的全新机制，为设计下一代基因载体提供了新的生物学靶点和思路。
2. 2.
   载体设计突破：提供了一种简单、通用、生物相容性高的基因递送平台。该平台可负载多种类型的核酸药物（DNA、siRNA、miRNA、mRNA），在多种细胞和疾病模型中均表现优异，克服了传统载体的毒性、免疫原性和逃逸效率低等缺陷。
3. 3.
   治疗潜力：在体外基因调控、离体细胞疗法和体内系统给药三个层面证明了其强大的治疗潜力，为癌症治疗、组织再生、纤维化疾病和遗传病等的基因治疗提供了新的有力工具。
4. 4.
   启发未来研究：研究表明，纳米载体的物理形态（如蠕虫状）可以特异性调控细胞内的生物学过程（如离子通道活性）。这启发研究人员未来可以设计具有不同形状、大小的纳米结构，通过与其他细胞组分（细胞器、受体、离子通道）的相互作用，开发出更多样化的内体逃逸策略，从而推动核酸纳米技术和基因治疗领域的进一步发展。