《SCIENCE ADVANCES》：Epithelial plasticity shapes intratumoral heterogeneity and cell lineages in early-stage lung cancer
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为阐明驱动早期肺腺癌(LUAD)瘤内异质性(ITH)产生的机制，研究人员通过单细胞与空间转录组学技术，结合整合计算分析和功能验证，系统描绘了早期肺腺癌的细胞与转录组异质性全景。研究发现，上皮可塑性（通过去分化与转分化）是驱动早期瘤内异质性形成的关键维度，揭示了独特的AT2向AT1转分化的过渡态，并鉴定出KLF4和JDP2是可将LUAD重编程至该过渡态、抑制肿瘤进展的关键转录因子，为靶向上皮可塑性的肺癌治疗策略提供了理论依据。
肺癌是全球癌症相关死亡的主要原因，其中肺腺癌(LUAD)是最常见的组织学亚型。肿瘤的转移和耐药是导致患者死亡的首要原因，而瘤内异质性(ITH)被广泛认为是驱动这些过程的关键因素。ITH使得肿瘤细胞能够适应环境压力，同时也增加了治疗的复杂性。然而，目前对ITH的研究多集中于局部晚期或转移性癌症，对早期癌症ITH的特点及其起源知之甚少。特别是在早期肺腺癌中，肿瘤细胞群的特征以及驱动ITH出现的机制仍不清楚。这如同在一片迷雾中探索肿瘤发展的最初轨迹，理解这片“初始森林”的多样性格局，对于从根源上遏制肿瘤的演进至关重要。
为了拨开这片迷雾，解开早期肺腺癌异质性的谜团，研究人员在《SCIENCE ADVANCES》上发表了一项研究。他们利用单细胞和空间转录组学技术，结合整合计算分析和功能验证，在单细胞分辨率下剖析了早期肺腺癌的细胞和转录组ITH。
研究人员开展这项研究主要运用了以下几个关键技术方法：研究收集了14例早期肺腺癌患者（包括6例微浸润性腺癌和6例I期浸润性腺癌）的新鲜肿瘤组织，进行了单细胞RNA测序(scRNA-seq)和空间转录组测序。通过生物信息学分析（如细胞聚类、拷贝数变异推断、拟时序分析、基因集富集分析等）和功能实验（包括细胞模型构建、CUT&Tag测序、小鼠异种移植模型等），系统解析了肿瘤细胞状态、异质性起源及其调控机制。
RESULTS
A single-cell transcriptional landscape of early-stage LUAD
通过对12例早期LUAD患者肿瘤组织进行scRNA-seq，共分析了103,375个细胞，鉴定出上皮细胞、内皮细胞、T细胞、NK细胞、B细胞、髓系细胞和肥大细胞等主要细胞类型。通过推断拷贝数变异(CNV)，从上皮细胞中识别出恶性细胞，并发现浸润性腺癌(IA)组中肿瘤细胞比例显著高于微浸润性腺癌(MIA)组，表明肿瘤细胞在从MIA向IA的进展中起关键作用。
Decreased differentiation is an indicator of early-stage LUAD progression
通过整合健康肺组织、早期（MIA/IA）、晚期和转移性LUAD的scRNA-seq数据，研究人员描绘了LUAD进展过程中的分子和细胞转变。他们发现，与健康肺泡Ⅱ型上皮细胞(AT2)相比，早期LUAD肿瘤细胞已显示出AT2/AT1谱系特征的进行性丢失，即“去分化”。这种去分化程度在从早期向晚期、转移性阶段发展过程中加剧，并且是恶性转化的一个关键表型特征。生存分析证实，在早期LUAD患者中，较高的AT2/AT1谱系特征与更好的总体生存率显著相关。
Intratumoral transcriptional heterogeneity in early-stage LUAD
通过主成分分析(PCA)和非负矩阵分解(NMF)等方法，研究人员系统地表征了早期LUAD中的ITH。他们发现，即使在肿瘤大小小于3厘米的早期LUAD中，所有肿瘤组织均已存在至少三个或更多转录组学上不同的肿瘤细胞簇，表明普遍的转录组ITH在早期就已存在。空间转录组学分析进一步在组织切片中直观验证了这些不同肿瘤细胞簇的共存。
Epithelial plasticity drives ITH in early-stage LUAD
研究从上皮细胞可塑性的角度探讨了肿瘤细胞的进化关系。谱系推断显示，不同的肿瘤细胞簇主要表现出混合的AT2/AT1谱系特征，并呈现出明显的肺泡谱系分化丢失谱。拟时序轨迹分析重建了肿瘤细胞簇之间的进化关系，显示具有最低AT2/AT1谱系评分的C1簇主要位于轨迹末端，而具有最高AT2或AT1谱系特征的C3和C2簇则位于轨迹起点。沿着推断的肿瘤进展轨迹，AT1/AT2谱系特征逐渐减弱。对小鼠LUAD模型数据的再分析证实，肿瘤细胞上皮分化特征的丢失显著增强了肿瘤细胞间的转录组多样性，新出现的肿瘤细胞簇在肿瘤进展过程中表现出AT2谱系特征的进行性丢失。这些结果表明，在肿瘤进展过程中，肿瘤细胞向低分化状态的转变触发了不同的细胞状态，其积累促进了早期LUAD中ITH的出现。此外，研究人员还观察到C2簇主要定位于肿瘤进化的一个分支，与AT2细胞向AT1细胞转分化的轴线重合。该簇高表达肺损伤修复过程中AT2向AT1转分化的过渡态标志基因，RNA速率和细胞分化状态推断分析进一步证实C2簇处于AT2向AT1转分化的过渡态。这表明肿瘤细胞利用保守的AT2-to-AT1转分化程序，是促成早期LUAD ITH发展的另一条独特机制途径。总之，肿瘤细胞通过积累向低分化状态转变的细胞以及转分化来改变上皮状态，从而驱动早期LUAD的ITH。
Co-occurrence of the proliferative state and immune-active state among cancer cell populations of the same early-stage LUAD
对肿瘤细胞簇功能的深入分析发现，C1簇具有最低的AT2/AT1特征，而C3簇具有最高的AT2特征和第二高的AT1特征。在疾病进展过程中，C1簇的比例显著增加，而C3簇的比例显著减少。基因集富集分析(GSEA)显示，C1簇显著富集于细胞生长、分化和细胞连接相关的基因，代表了恶性细胞的增殖信号特征；而C3簇则显著富集于免疫反应通路，包括T细胞活化、免疫细胞募集和主要组织相容性复合体(MHC)蛋白复合物抗原呈递，表明肿瘤细胞具有强烈的免疫反应特征。细胞通讯分析表明，C3簇细胞与免疫细胞的相互作用最为频繁，而C1簇与基质细胞和免疫细胞的相互作用最少。空间分析显示，C3恶性细胞与免疫细胞紧邻，而C1细胞与免疫细胞的空间距离最远。生存分析表明，C1特征升高与不良预后显著相关，而高C3特征与良好的临床结果相关。这些发现证明了在肿瘤尺寸小于3厘米的早期LUAD中，增殖状态(C1)和免疫活跃状态(C3)的肿瘤细胞簇共存，其分子特征可作为预后的预测性生物标志物。
Transcriptional regulatory events during the AT2-to-AT1 transitional state in early-stage LUAD
C2簇被表征为AT2-to-AT1过渡态，其标志性转录因子(TF) KLF4表达显著高于其他所有簇。免疫荧光染色证实了肿瘤组织中存在KLF4+癌细胞，并且KLF4与过渡态标志物CLDN4共表达。进一步分析显示，C2簇具有最高的AT1特征、抑癌通路（如p53和凋亡信号通路）活性升高、以及G2-M期细胞周期阻滞的分子特征。该簇差异表达大量肿瘤抑制基因(TSG)，表明其在早期LUAD的这一过渡态中可能具有抑癌作用。通过单细胞调控网络推断和聚类(SCENIC)分析及整合NMF模块的转录因子分析，鉴定出KLF4和 JDP2是C2簇特异的转录调节因子。二者表达正相关，且JDP2在LUAD肿瘤样本中的表达显著低于癌旁正常组织。研究将C2簇鉴定为一个由KLF4/JDP2转录调控网络控制的、具有抑癌特性的AT2-to-AT1分化过渡态。
Reprogramming LUAD into AT2-to-AT1 transitional state by KLF4/JDP2 overexpression suppresses tumor progression
研究发现C2簇独特地富集了肿瘤抑制基因，因此将肿瘤细胞恢复至具有高抑癌基因表达的C2过渡态可能成为一种治疗策略。功能实验表明，在KLF4低表达的LUAD细胞系中重新表达KLF4或过表达JDP2，能够抑制细胞增殖、迁移和体内肿瘤生长。CUT&Tag测序和RNA-seq分析证实，KLF4和JDP2直接调控关键的过渡态标志物和C2簇特异性基因，其过表达能重建C2过渡态特征，并促进肿瘤细胞重编程为具有AT1样特征的表型，同时保留AT2特征。这些结果表明，KLF4和JDP2可作为关键的转录调节因子，恢复C2过渡态，从而将恶性细胞重编程为侵袭性较低、具有AT1分化潜能的表型。
DISCUSSION
本研究通过高分辨率的单细胞和空间转录组学技术揭示，早期肺腺癌远非同质，而是表现出显著的转录组瘤内异质性，为肿瘤可塑性和进化提供了多样性来源。研究发现，从谱系发展的角度看，LUAD进展过程中存在一个连续的去分化事件谱，且这一过程在早期LUAD组织内已可观察到。肿瘤细胞通过向上皮可塑性（向低分化状态转变和转分化）驱动的谱系多样化，是肺癌早期ITH产生的一个关键维度。研究人员鉴定出早期LUAD中共存的增殖状态(C1)和免疫活跃状态(C3)细胞簇，可作为预后的预测生物标志物。尤为重要的是，发现了一个以肿瘤抑制通路激活为特征的AT2-to-AT1过渡态(C2簇)，并确立了KLF4和JDP2作为能够恢复该过渡态、将恶性细胞重编程为侵袭性较低表型的关键转录调节因子。这些发现阐明了早期癌症中ITH的机制，提出了靶向上皮可塑性的治疗新思路，例如联合治疗靶向共存的细胞状态，或分化疗法将细胞从增殖状态转变为免疫活跃状态。尽管目前发现局限于LUAD，但未来在单细胞分辨率下进行的多癌种研究，将有望确立细胞谱系状态与转录组ITH之间的这种关联是否代表一种具有广泛生物学意义的泛癌现象。
