《Aquatic Toxicology》：Systematic
In Vivo (Zebrafish) and
In Vitro Study on Nanoplastics-Induced AChE Inhibition
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本研究通过斑马鱼体内和体外纯化酶实验，揭示了聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）抑制脑乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的双重机制：诱导氧化应激及直接改变酶分子构象。维生素E干预可缓解上述效应，为新兴塑料污染物的神经毒性评估提供理论依据。
宋雅清|庞吉蕾|李振珠|池振星
哈尔滨工业大学海洋科学与技术学院，威海，264209，中国
摘要
纳米塑料（NPs）是新兴的环境污染物，对水生生物和人类健康构成威胁。本研究结合了体内（斑马鱼）和体外（纯化酶）方法，系统地研究了聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）对脑乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的神经毒性作用，并阐明了其潜在机制。斑马鱼在0.02、0.2、2 mg·L?1的PS-NPs浓度下暴露28天后，表现出脑AChE活性的浓度和时间依赖性抑制、抗氧化防御系统的破坏（SOD/CAT比值改变、ROS/MDA水平升高）以及神经组织病理损伤。维生素E的干预显著减轻了AChE活性的下降和氧化应激指标。体外实验表明，PS-NPs直接抑制了纯化AChE的活性。光谱分析（UV-Vis、CD、荧光）证实了PS-NPs引起的荧光淬灭、氨基酸微环境的变化以及二级结构重组，这些变化使得酶的构象更加紧密，可能阻碍了底物的结合。本研究首次证明PS-NPs通过两种协同机制抑制AChE活性：氧化应激诱导和直接干扰AChE的分子构象。我们的发现加深了对纳米塑料神经毒性的机制理解，为开发针对新兴塑料污染物的早期预警指标和风险评估框架提供了理论基础。
引言
由于塑料具有优异的物理化学性质和低成本，已成为全球工业和日常生活中的不可或缺的材料。全球塑料产量持续增长，预计到2050年将达到330亿吨（Ivleva等，2017；Rillig & Lehmann，2020）。然而，广泛使用导致塑料在环境中大量积累。由于化学稳定性，大多数塑料难以自然降解；到2015年，只有9%的塑料被回收利用（Geyer等，2017）。塑料碎片通过物理、化学和生物过程逐渐分解为微塑料（MPs；粒径<5 mm），并进一步分解为纳米塑料（NPs；粒径<100 nm）（Geyer等，2017；K. Zhang等，2021）。
与微塑料相比，纳米塑料由于其纳米级尺寸，具有更大的环境迁移性和跨越生物屏障的能力，对生态系统和人类健康构成更大的风险（Geyer等，2017）。纳米塑料已在多个环境领域被广泛检测到，包括深海沟槽（Jamieson等，2019）、淡水系统（Yuan等，2019a）、极地冰川和大气（Allen等，2019；Dris等，2017），表明它们已成为全球普遍存在的污染物。
纳米塑料在全球各种环境介质中均有发现，包括深海沟槽（Jamieson等，2019）、淡水系统（Yuan等，2019a）和大气（Allen等，2019）。据报道，表层水中的纳米塑料浓度为5–34粒子·L?1（Yuan等，2019b），而在热带河流系统中则超过500,000粒子·m?3（Lahens等，2018），即使在偏远地区，大气沉降通量也高达365粒子·(m2·day)?1（Allen等，2019）。这种在环境介质中的普遍分布及其显著的跨介质传输能力构成了一个紧迫的全球污染挑战。
根据来源不同，纳米塑料可分为初级纳米塑料（在纳米尺度制造，例如化妆品和清洁产品中的微珠）和次级纳米塑料（由较大塑料制品降解而来）（Horton等，2017）。分析检测方法的进步逐渐提高了对环境纳米塑料的识别和定量能力，同时也提高了对其潜在危害的认识（Filella，2015）。
毒理学研究记录了纳米塑料在多种生物模型和器官系统中的不良影响。已知的影响包括呼吸上皮细胞的线粒体功能障碍（H. Zhang等，2022）、肾小管上皮细胞的损伤伴随炎症反应（Abarghouei等，2021；Y.-C. Chen等，2022）以及肝脏的氧化损伤和组织病理变化（Araújo等，2020）。特别值得关注的是神经毒性：纳米塑料已被证明会改变水生生物的运动行为，并常与乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的降低相关（Q. Chen等，2017；Qiang & Cheng，2019；Ziani等，2023）。纳米塑料对中枢神经系统（CNS）的影响可能涉及氧化损伤、突触可塑性的破坏、胆碱能神经递质代谢的紊乱，在某些情况下还会穿透血脑屏障后直接作用于脑组织（S. Wang等，2022）。
乙酰胆碱酯酶（AChE）是胆碱能系统的关键水解酶，负责快速分解神经递质乙酰胆碱（ACh），从而精确调节突触传递并维持学习、记忆和运动控制等生理功能（Wu等，2016）。AChE活性的失调与多种神经系统疾病的发病机制密切相关，包括阿尔茨海默病（Volpato & Holzgrabe，2018a）。先前的研究表明，多种污染物（如多溴联苯醚和有机磷杀虫剂）可以通过构象异构化、共价修饰或诱导氧化应激等机制直接或间接调节AChE活性，从而促进神经毒性（Buffenstein等，2008；Melo等，2003；S. Wang等，2018；Yang & Lian，2020）。
尽管人们对纳米塑料的神经毒性越来越感兴趣，但纳米塑料对胆碱能系统（尤其是AChE活性）的影响及其潜在的分子机制仍不完全清楚。现有研究主要集中在体内现象观察上；纳米塑料如何在分子水平上直接与AChE相互作用，以及氧化应激如何与AChE的结构和功能变化机制相关联，仍不清楚。因此，从机制上理解纳米塑料抑制AChE的多种途径对于全面评估其神经毒性潜力以及开发针对这些新兴污染物的早期预警和风险评估框架至关重要。
本研究旨在通过结合体内（斑马鱼，Danio rerio）和体外（纯化AChE）方法，系统研究聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）对AChE的神经毒性作用，并阐明涉及的详细分子机制。具体而言，我们将评估PS-NPs暴露对斑马鱼脑AChE活性、抗氧化防御参数（ROS、MDA、SOD、CAT）和神经组织病理的影响，并利用抗氧化干预来评估氧化应激的因果作用。同时，将使用紫外-可见吸收光谱、圆二色性和荧光光谱技术探讨PS-NPs与纯化AChE之间的分子水平相互作用，以表征纳米塑料引起的结构变化。我们假设纳米塑料通过两种协同机制抑制AChE活性：诱导氧化应激和直接干扰AChE的分子构象，从而导致观察到的神经毒性效应。本研究有望加深对纳米塑料神经毒性的机制理解，并为开发针对新兴塑料污染物的早期预警指标和风险评估策略提供理论基础。
实验材料
聚苯乙烯微球（30nm）[CAS: 9003-53-6，纯度>99%]购自常州智川微球生物科技有限公司。PS-NPs以2.5%（w/v）的浓度悬浮在纯水中提供，不含荧光标记物或表面功能基团。详细表征确认其具有球形形态，初级直径为30nm（通过TEM），流体力学直径为32nm（通过LS），表面电荷略带负电（Zeta电位）。
PS-NPs对斑马鱼脑中AChE活性的影响
进行了体内暴露实验，以评估聚苯乙烯纳米颗粒（PS-NPs）对斑马鱼脑组织中乙酰胆碱酯酶（AChE）活性的影响。在整个28天的暴露期间，所有实验组均未观察到显著死亡率。所有组的累积存活率均保持在98.5%以上，表明选定的浓度（0.02、0.2和2 mg·L?1）对成年斑马鱼属于亚致死暴露水平。如图1所示，
结论
通过结合体内（斑马鱼）和体外方法，本研究系统阐明了聚苯乙烯纳米塑料（PS-NPs）对乙酰胆碱酯酶（AChE）的神经毒性作用及其潜在的分子机制。我们的结果表明，PS-NPs以浓度和时间依赖的方式显著抑制了斑马鱼脑中的AChE活性。这种抑制作用主要通过两种协同机制实现。首先，PS-NPs在脑组织中诱导氧化应激，
数据可用性
本研究生成或分析的所有数据均包含在发表的文章及其图表中。原始数据集（单独的生化测量值和原始光谱文件）可根据合理请求从相应作者处获取。
作者声明
宋雅清：研究、数据管理、撰写——初稿。庞吉蕾：研究、数据管理、方法学。李振珠：研究、资源支持、撰写-审阅与编辑。池振星：研究、方法学、监督、资金获取、项目管理、资源支持。
IACUC批准
所有动物实验均按照哈尔滨工业大学实验动物福利伦理委员会批准的方案进行（批准编号IACUC-2025024），并且实验符合ARRIVE指南，遵循了人道对待动物的国际标准。
手稿准备过程中未使用生成式人工智能和AI辅助技术声明
作者声明本手稿的撰写过程中未使用任何生成式人工智能（AI）或AI辅助技术。
未引用参考文献
Dong等，2020；Everaert等，2020；Howe等，2013；Abbasi等，2019；Klein和Fischer，2019；Liu和Zheng，2025；Vermaire等，2017；Wang等，2021；Zhang等，2002；Cai等，2017
作者贡献声明
宋雅清：撰写——初稿，研究，数据管理。庞吉蕾：方法学，研究，数据管理。李振珠：撰写——审阅与编辑，资源支持，研究。池振星：监督，资源支持，项目管理，方法学，研究，资金获取。
