《Aquatic Toxicology》：Impact of bisphenol A and ethinyloestradiol on sex, body condition and digit ratio of the marsh frog
Pelophylax ridibundus in the mesocosm exposure system
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本研究通过户外微宇宙系统，评估双酚A（BPA）和17α-雌二醇（EE2）对沼蛙（P. ridibundus）体况、性腺分化和2D:4D比率的影响。结果显示，高浓度BPA和EE2显著降低体况指标，EE2导致雌性比例失衡（≈9:1），并出现性发育异常个体；BPA虽不影响性别比例，但导致雄性性腺退化。研究表明， environmentally relevant浓度的EDCs可能干扰两栖动物性发育和体况，提示其在生物多样性保护中的重要性。
Martyna Fr?tczak|Katarzyna Szkudelska|Marta Grobelna|Adam Hermaniuk|?ukasz Jankowiak|Miko?aj Kaczmarski|?ukasz Myczko|Beata Rozenblut-Ko?cisty|Piotr Tryjanowski
波兹南生命科学大学动物学系，波兰波兹南Wojska Polskiego 71C，60-625
摘要 本研究考察了两种广泛存在于环境中的内分泌干扰物（EDCs）——双酚A（BPA）和17α-乙炔雌二醇（EE2）对沼泽蛙Pelophylax ridibundus 的影响。分析重点关注了其体况、性腺分化以及第二至第四指比例（DR，2D:4D），后者被用作潜在的内分泌干扰非侵入性生物标志物。蝌蚪在户外中型生态系统中饲养，并每周暴露于三种与环境相关的BPA浓度（BPA7 - 10??、BPA8 - 10??、BPA9 - 10?? M）和一种EE2浓度（10?? M）下，后者作为阳性对照。暴露过程在静态更新系统中进行。虽然处理方式或性别对吻部至肛门长度（SVL）或体重没有影响，但在最高浓度的BPA组（–0.139 ± 0.036）和EE2组（–0.173 ± 0.036）中，鳞片质量指数（SMI）显著降低，表明体况受损。EE2导致性别比例明显偏向雌性（约9:1），使雌性出现的几率增加了5.2倍，而BPA则未影响性别比例。组织学分析显示EE2组中有两个两性畸形个体和一个混合性别个体。在BPA暴露的雄性中观察到显著的性腺退化及原始变态结构，雌性中也发现了类似现象，表明性腺发育受到干扰。尽管2D:4D在性别间没有差异，但EE2和BPA都以与体型相关的程度改变了指比例，在后肢（EE2组）和左前肢（EE2组）中存在处理×SVL的显著交互作用，其中较大个体在暴露下的比例较低。这些与环境相关的发现表明，BPA和EE2严重扰乱了非模式两栖动物的体况健康、性腺分化和与性别相关的特征，对野生动物保护具有明确意义。
引言 内分泌干扰物（EDCs）是一类外源性化学物质，它们通过模拟、阻断或以其他方式改变激素信号通路来干扰内分泌系统（La Merrill等人，2020年）。大多数环境中的EDCs来源于人为来源，如工业化学品、药品和个人护理产品。这些化合物已被证明会影响多种激素轴，尤其是涉及雌激素、雄激素和甲状腺激素的轴，并在广泛的脊椎动物类群中产生了记录在案的影响（Kloas等人，2024年；La Merrill等人，2020年）。
EDCs在欧洲乃至全球的地表水中广泛存在（Puri等人，2023年），它们可能影响水生生物的繁殖、发育和生存。两栖动物由于皮肤具有渗透性且发育过程发生在体外，因此特别容易受到影响，并被视为水污染的敏感生物指示器（Fr?tczak等人，2025b年；Kloas等人，2024年）。因此，了解EDCs如何影响两栖动物的发育不仅从生理学角度重要，也对生物多样性保护和生态风险评估具有重要意义（Heimeier和Shi，2010年；Kloas等人，2024年）。
在地表水中检测到的最常见EDCs包括双酚A（BPA）和17α-乙炔雌二醇（EE2）。BPA是一种高产量化学品，常用于塑料和环氧树脂的制造。作为一种外源性雌激素，BPA与雌激素、甲状腺激素和雄激素受体相互作用，干扰多种内分泌通路（Heimeier和Shi，2010年；Li等人，2022年）。在两栖动物中，BPA暴露与性腺雌性化、甲状腺功能障碍和性别比例改变有关，尽管反应通常具有物种特异性，且研究结果并不一致（Kloas等人，1999年；Tamschick等人，2016a年）。EE2是一种广泛用于口服避孕药的合成雌激素，也是一种强效的内分泌干扰物，常在水生环境中发现。它对多种两栖动物具有强烈的雌性化效应，经常导致混合性别表型或完全的雄性向雌性转变（Mackenzie等人，2003年；Pettersson和Berg，2007年；Tamschick等人，2016b年；Tompsett等人，2012年；Ujhegyi和Bókony，2020年）。
对于许多两栖动物物种来说，以非侵入性方式监测EDCs的影响是一个重大挑战（Ujhegyi和Bókony，2020年）。大多数物种缺乏外部性别二态特征，而且许多物种缺乏遗传性别鉴定工具（Bullejos等人，2024年）。因此，人们越来越关注寻找非侵入性的性别鉴定标志物以及EDCs对两栖动物影响的标志物（Ujhegyi和Bókony，2020年）。在这项研究中，我们旨在探索第二至第四指比例（2D:4D）作为两栖动物性别和内分泌干扰非侵入性指标的潜力。2D:4D是一种被认为反映早期激素影响的形态特征，并已被证明与多种类群的性别和其他生理特征相关（Lofeu等人，2017年；Manning，2002年）。然而，关于两栖动物中2D:4D的研究仍然很少，许多现有研究依赖于有问题的假设，例如手指编号的顺序，这些假设最近受到了批判性重新评估（Fr?tczak等人，2025a年；Kaczmarski等人，2021年）。
本研究旨在探讨BPA（以EE2作为阳性对照）对非模式物种Pelophylax ridibundus （Pallas，1771年）的性腺分化和外部形态特征（包括2D:4D指比例）的影响。Pelophylax ridibundus 是一种广泛分布的欧洲两栖动物，主要生活在水中（Berger，1977年），因此全年持续暴露于水传播的污染物中。它在深水体和大型河流中繁殖（Berger，1977年），经常接触到废水排放物，使其成为评估EDCs生态风险的理想物种。通过关注该物种的性腺分化和指比例，本研究旨在阐明EDCs如何影响两栖动物的性发育，并评估指比例作为内分泌干扰非侵入性生物标志物的潜力。
实验动物 我们从一家持证的商业繁殖者（Frogs Po-Land，
https://frogs-po-land.com ）处获得了3对
P. ridibundus 的受精卵。由于欧洲水蛙复合体
Pelophylax esculentus （Berger，1977年）的杂合遗传系统，通过分子方法验证了亲本对的基因型，以确保实验样本来自非入侵的
P. ridibundus 。通过扩增
serum 基因组片段进行了物种鉴定。
水槽条件 每周在随机选取的水槽中测量目标BPA浓度，BPA7组的浓度范围为1,00×10?? M至1,48×10?? M，BPA8组的浓度范围为1,00×10?? M至1,28×10?? M，BPA9组的浓度范围为1×10?? M至2,27×10?? M。在阴性对照组和EE2组中未检测到BPA。阳性对照组中的EE2浓度范围为1,36×10?? M至2,1×10?? M。在阴性对照组和BPA组中均未检测到EE2。EDCs的分析结果总结在表S2中。
没有
水槽条件 在这项研究中，我们采用了中型生态系统，以提供比标准实验室实验更接近实际环境的暴露条件。中型生态系统结合了较大的水体和半自然环境，使实验动物能够在更接近自然栖息地的条件下发育，同时仍能控制关键变量。不同水槽之间目标EDCs浓度的差异可能反映了自然异质性和采样差异。
结论 本研究表明，暴露于两种常见的内分泌干扰物BPA和EE2会影响P. ridibundus 的性发育、性别比例和体况。这些发现表明，即使是低浓度的环境相关物质也可能损害对种群稳定性至关重要的特征，从而对受污染栖息地的生物多样性产生潜在影响。尽管2D:4D指比例在这项研究中未能可靠地区分性别，
CRediT作者贡献声明 Martyna Fr?tczak：概念化、资金获取、方法论、研究、初稿撰写、审稿与编辑。Katarzyna Szkudelska：概念化、方法论、研究、审稿与编辑。Marta Grobelna：研究、审稿与编辑。Adam Hermaniuk：概念化、方法论、审稿与编辑。?ukasz Jankowiak：形式分析、可视化、审稿与编辑。Miko?aj Kaczmarski：概念化。
资金支持 本工作得到了波兰国家科学中心的研究资助（项目编号UMO2023/49/N/NZ8/01103）。
数据获取 研究中使用的额外数据和统计模型可在补充材料中找到。本研究中分析的原始数据集可应要求向相应作者索取。CRediT作者贡献声明 Martyna Fr?tczak： 审稿与编辑、初稿撰写、方法论、研究、资金获取、概念化。Katarzyna Szkudelska： 审稿与编辑、监督、方法论、研究、概念化。Marta Grobelna： 审稿与编辑、研究。Adam Hermaniuk： 审稿与编辑、方法论、概念化。?ukasz Jankowiak： 审稿与编辑、可视化、形式分析。Miko?aj Kaczmarski： 审稿
