D-氨基酸氨基转移酶1通过调节内质网应激反应调控水稻籽粒垩白

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：D-amino acid aminotransferase1 regulates grain chalkiness in rice by modulating endoplasmic reticulum stress response

本研究首次揭示了水稻D-氨基酸（D-amino acid）代谢通路及其关键基因OsDAAT1（D-amino acid aminotransferase1）在调控籽粒外观品质（grain chalkiness）中的核心作用。研究发现，OsDAAT1通过调控D-丙氨酸（D-Ala）等D-氨基酸的体内稳态，影响肽/蛋白质的异构化，进而诱导内质网应激反应（ER stress），最终导致垩白形成。该研究不仅阐明了一个此前未被认知的、由母体组织主导的调控新机制，其发现的优异单倍型OsDAAT1Hap1更为水稻品质分子育种提供了直接靶点。

　　

Phenotypic Characterization and Map-Based Cloning of OsDAAT1.

研究人员从一个由粳稻品种日本晴（Nipponbar）组织培养衍生的群体中，筛选得到一个垩白籽粒突变体daat1。与野生型相比，该突变体的垩白粒率和胚乳垩白度均显著增加，同时灌浆速率减慢，千粒重降低，植株的农艺性状也受到广泛影响。通过正反交实验，研究人员发现只有当母本为daat1纯合体时，F₁代种子才会表现出垩白表型，证明该表型受母体组织环境控制。利用图位克隆技术，研究者将目标基因定位在3号染色体上一个48-kb的区间内，测序分析揭示该区域存在一个4,931-bp的缺失，覆盖了候选基因LOC_Os03g24460的部分外显子，导致其表达几乎完全丧失。通过基因组互补实验和CRISPR/Cas9敲除实验，最终证实LOC_Os03g24460即为控制该表型的基因，并将其命名为OsDAAT1。进一步的表达特异性沉默实验（使用Ubiquitin组成型启动子或GlutelinC胚乳特异性启动子驱动RNAi）表明，只有组成型沉默OsDAAT1才会重现垩白表型，而胚乳特异性沉默则产生透明籽粒，这进一步支持了OsDAAT1通过母体组织而非胚乳自身功能来调控籽粒垩白的结论。

OsDAAT1 Encodes a Functional D-Amino Acid Aminotransferase in Rice.

表达谱分析显示，OsDAAT1主要在营养组织，尤其是节点中高表达，原位杂交将其转录本精确定位于节点的维管组织中，免疫印迹也证实其蛋白在节点和胚乳中富集。亚细胞定位实验表明OsDAAT1是一个定位于细胞质的蛋白质。OsDAAT1编码一个含有保守D-氨基酸氨基转移酶结构域的蛋白。体外酶活实验证明，重组OsDAAT1蛋白能够以多种D-氨基酸（如D-谷氨酸、D-甲硫氨酸、D-丝氨酸）为氨基供体，以丙酮酸为氨基受体，催化生成D-丙氨酸；反之，也能以D-丙氨酸为供体，α-酮戊二酸为受体生成D-谷氨酸，证实OsDAAT1是一种广谱的D-氨基酸氨基转移酶。对体内D-氨基酸含量的测定发现，在daat1突变体的茎、节点和发育中的种子中，D-丙氨酸含量显著升高，而D-丝氨酸在茎和节点中含量降低，在种子中变化不显著，说明OsDAAT1突变主要干扰了D-丙氨酸的代谢稳态，且这种紊乱在母体组织中尤为明显。

OsDAAT1 Mutation Induced ER Stress Response during Grain Development.

对野生型和daat1突变体在开花后9天（9 DAF）的发育种子进行RNA测序分析，发现大量差异表达基因，KEGG通路富集分析显示这些基因显著富集于内质网中的蛋白质加工等通路。内质网应激相关基因在突变体中广泛上调，RT-qPCR和免疫印迹分析验证了这一点，同时透射电镜清晰地显示daat1胚乳细胞中存在肿胀和异常的内质网结构，表明内质网功能紊乱。考虑到严重的籽粒垩白与胚乳发育期间的内质网应激密切相关，这些结果证明OsDAAT1的突变诱导了严重的内质网应激。为了探究D-氨基酸积累与内质网应激之间的功能联系，研究者将荧光D-丙氨酸类似物（HADA）注射到水稻茎节，发现其可被运输至发育中的种子。外源注射D-丙氨酸、D-丝氨酸、D-甲硫氨酸均能诱导胚乳细胞中内质网应激相关基因的表达上调。类似地，用水培幼苗进行外源D-氨基酸处理也观察到了内质网应激基因的快速诱导。这些结果表明，daat1中过量积累的D-氨基酸可能引发持续的内质网应激反应。

OsDAAT1 Mutation Altered the Protein Isomerization Levels and Extent.

蛋白质通常由L-氨基酸构成，但含有D-氨基酸的肽和蛋白质在细菌和动物中已有报道。为了探究植物中是否存在此类异构体，以及D-氨基酸代谢紊乱是否影响其异构化，研究者对9 DAF的种子进行了基于质谱的蛋白质组学分析。通过自定制的异构体检索算法，他们在水稻发育种子中鉴定到了含有D-氨基酸的异构肽和异构蛋白。与野生型相比，daat1突变体不仅总蛋白和总肽段的鉴定数量有所变化，其独特的异构蛋白和异构肽段的鉴定比例更是显著提高，表明立体蛋白质组学分析能极大增强覆盖深度。虽然突变体整体蛋白质异构化水平与序列STEP比的差异不显著，但进一步的定量分析揭示了特定肽段异构化水平的显著变化。热图分析显示，一些功能蛋白（如谷蛋白、cupin家族蛋白、蛋白质二硫键异构酶PDI、多种种子贮藏蛋白）衍生肽段的异构化水平在daat1中发生显著改变，但在互补转基因株系中恢复到接近野生型的水平。主成分分析也将野生型和互补株系聚为一类，与daat1突变体清晰分开。这些结果提示，daat1功能的缺失可能通过影响异构化修饰，改变了种子贮藏蛋白和PDI等蛋白的高级结构。

Natural Variations in OsDAAT1 Promoter Region Associate with Grain Chalkiness.

为了评估OsDAAT1的自然变异对水稻籽粒垩白的贡献，研究者分析了536份水稻种质资源中OsDAAT1编码区及上下游区域的核苷酸多态性，发现了16个与籽粒垩白显著相关的单核苷酸多态性位点，其中7个位于启动子区。基于这7个SNP，划分出两种单倍型：Hap1和Hap2。表型关联分析表明，携带Hap1的品种其垩白粒率和胚乳垩白度均显著低于携带Hap2的品种，Hap1被确定为低垩白的优异单倍型。双荧光素酶报告系统检测显示，Hap1单倍型具有更强的转录激活能力，相应的，携带Hap1的品种中OsDAAT1的表达水平也显著高于携带Hap2的品种。在9311（Hap1）背景下导入PA64s（Hap2）的OsDAAT1染色体片段，构建的染色体片段代换系在所有五个株系中都表现出显著更高的垩白粒率，这直接证明了启动子区自然变异通过影响OsDAAT1表达来调控垩白。对野生稻、地方品种和现代栽培品种的进化分析显示，OsDAAT1^Hap1在野生稻中已占主导，在驯化和育种过程中，Hap1的比例在现代品种中急剧增加至近100%，且该区域的核苷酸多样性在籼稻和粳稻中均显著低于野生稻，这些证据共同表明OsDAAT1可能在稻作驯化过程中经历了人工选择。

Discussion

本研究证实OsDAAT1编码一个具有广泛底物活性的D-氨基酸氨基转移酶，其突变主要导致D-丙氨酸代谢紊乱。D-氨基酸可能通过竞争性掺入新生多肽链或酶促翻译后差向异构化改变蛋白质的立体化学。本研究的蛋白质组学数据直接证明了植物中存在含有D-氨基酸的异构肽/蛋白，且daat1突变体的异构化谱与野生型不同。这种立体化学改变可能破坏内质网中的蛋白质折叠与加工，从而触发未折叠蛋白反应。daat1组织中升高的D-丙氨酸水平与严重的内质网应激相吻合，而外源D-氨基酸处理也能在野生型中重现应激反应，支持了这一假说。持续的严重内质网应激会破坏贮藏物质（淀粉和蛋白质）的积累，从而导致垩白形成。遗传和表达分析表明，OsDAAT1以隐性母体孢子体方式调控籽粒垩白，其高表达于茎、节点维管组织，以及D-氨基酸稳态在这些母体组织（特别是作为主要运输组织的节点）中被破坏，暗示代谢稳态紊乱可能影响了向籽粒的营养运输。总之，该研究揭示了OsDAAT1通过调控D-氨基酸代谢以维持内质网稳态，从而母体性调控籽粒品质的新机制，其发现的优异单倍型OsDAAT1^Hap1为水稻外观品质改良提供了宝贵的遗传资源。