回复陈：在研究H3-Dendra2分布时的方法论和分析考量

《Proceedings of the National Academy of Sciences》：Reply to Chen: Methodological and analytical considerations in the study of H3-Dendra2 distribution

组蛋白不对称分配在果蝇干细胞中的验证与统计方法优化。

　　

陈（1）最近的一条评论对我们的研究结果提出了一些质疑，该研究关注的是果蝇（Drosophila）干细胞中组蛋白（histones）的分配情况（2）。我们提供了详细的逐点回应，其中包括所有的实验控制和数据重新分析结果，并已公开发布（3）。在回应中，我们针对统计解释、方法论和技术严谨性等方面进行了澄清。

陈重新分析了我们使用Gal4/上游激活序列（UAS）Flp-out系统获得的数据，正确地指出了H3.1在肠干细胞-肠上皮细胞（ISC-EB）对中的比例存在统计学上的显著偏差（P < 0.05）。然而，仅凭这一指标并不能支持她提出的“老”组蛋白（H3.1-绿色荧光蛋白（GFP）在干细胞中持续富集的模型（4）。显著的P值只是排除了完全对称的零假设，并不能确定偏差的方向。实际上，ISC-EB对中H3.1-GFP的平均荧光比率（以log₂为单位）小于1（见参考文献2中的SI附录，图S8B），这与预测的ISC中信号增强的情况直接矛盾。此外，我们的成像数据也与预测的单向模式不符。我们观察到H3.1-mKO在不同的细胞对中可能同时富集在ISC或EB中（图1A）。这种变异性可能是因为在constitutive Gal4/UAS Flp-out系统中，重组可以独立发生在ISC或EB中，而不一定反映最近发生的有丝分裂事件。为了明确评估有丝分裂过程中H3.1-GFP和H3.1-mKO的分配情况，我们将分析重点放在通过磷酸化组蛋白H3（PH3）染色识别的有丝分裂中的ISC-EB对上（见参考文献2中的SI附录，图S9）。这些分裂细胞的分布显示在二维图中（图1B），它们对称地聚集在原点周围，表明总体上不存在系统性不对称。

图1.

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ISC-EB对中H3.1-mKO的不对称分布情况，以及新旧组蛋白分布模式的二维图分析。（A）使用Gal4/UAS Flp-out系统，代表性图像显示H3.1-mKO（新组蛋白）在EB或ISC中富集。（B）在ISC不对称分裂过程中H3.1-GFP（老组蛋白）和H3.1-mKO（新组蛋白）的分布（对应于参考文献2的SI附录，图S9B）以及GSC不对称分裂（对应于参考文献2的SI附录，图S10B）。[比例尺：5 μm（A）。]

陈对光转换效率和潜在的成像伪影提出了具体担忧，我们在完整的回应中通过专门的对照实验对这些问题进行了解答（3）。关于光转换效率，转化后红光与绿光荧光比率的变化源于细胞间H3-Dendra2蛋白表达量的固有差异，而非转化不完全（图2A和3）。重要的是，根据我们的体内光转换协议，每个被分析的esg⁺细胞中的绿色Dendra2信号都被降低到了背景水平，这证实了转化的高效率（图2A）。为了排除共聚焦成像过程中意外发生光转换的可能性，我们对固定样本进行了连续的高功率激光照射测试。我们证明，无论是405纳米还是488纳米的激光线，即使在较高功率下，也无法产生光转换后的Dendra2的红色荧光；它们只会导致光漂白（图2B和3）。这证实了我们的标准图像采集设置不会人为地产生“老”组蛋白信号。最后，关于潜在的光谱渗漏问题，我们证明在远红通道（Alexa Fluor 647）检测到的PH3信号在红色Dendra2通道中是不存在的，从而确认了我们分离测量的定量准确性（图2C）。综上所述，这些控制措施验证了我们基于光转换的追踪方法的可靠性。

图2.

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组蛋白-Dendra2成像和分析的技术控制措施。（A）细胞间Dendra2表达水平的差异（对应于Li等人（2）的图1C）。"Before"和"After"图像中的白色虚线框（编号1至3）标记了信号强度不同的esg⁺细胞。（B）405纳米激光无法使固定的H3.1-Dendra2发生光转换。连续图像显示了漂白前的同一区域（初始状态）、高功率405纳米激光漂白过程中（白色方块），以及漂白后的初始成像条件。（C）在未发生光转换的样本中，PH3染色不会渗入红色Dendra2通道。使用我们在论文中使用的成像设置（2），相应的555纳米通道没有检测到信号。[比例尺：10 μm（A和B）；5 μm（C）。]

总之，利用内源性调控的组蛋白获得的数据，并经过严格的技术验证，有力地证明了在我们研究的几种不对称干细胞分裂过程中，老组蛋白和新组蛋白H3.1的分配是对称的。