《Biosensors and Bioelectronics》：On-site microRNA detection with ‘off-the-shelf’ glucose meter empowered by chimeric probe connecting CRISPR/Cas13a activation to kinases-driven glucose phosphorylation
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微RNA检测平台KEY-FACT通过燃料辅助CRISPR激活释放cAMP，经激酶酶促磷酸化葡萄糖实现便携式血糖仪检测，灵敏度达1.4 pM，适用于胃癌标志物miR-135b和miR-21的现场诊断。
作者名单：Hyojeong Kim | Dongchan Kim | Hyogu Han | Changyeon Lee | Yoon Ho Roh | Tae-Su Han | Eun-Kyung Lim | Juhyuk Park | Jun Ki Ahn | Taejoon Kang | Juyeon Jung | Chang Yeol Lee
韩国生物科学与生物技术研究院（KRIBB）生物纳米技术研究中心，大田市，34141，韩国
摘要
微小RNA（miRNAs）由于其在体液中的稳定性及疾病特异性表达模式，成为癌症诊断的潜在生物标志物。然而，现有的检测方法存在一些局限性，包括繁琐的工作流程、需要复杂的仪器进行信号读取，或对仪器设备的依赖性较高。为了解决这些问题，我们开发了一种新型的即时检测平台，该平台可以利用市售的个人血糖仪（PGM），称为“KEY-FACT”（基于激酶集合体的燃料辅助CRISPR激活下的葡萄糖磷酸化）。当识别出目标miRNA时，燃料辅助的链置换反应会释放引导RNA（gRNAs），从而激活Cas13a切割嵌合报告探针，生成2’,3’-环腺苷单磷酸（cAMP）。随后的去磷酸化和激酶集合体介导的磷酸化/去磷酸化循环会导致cAMP大量消耗葡萄糖。用户可以立即使用PGM在现场测量葡萄糖水平的变化。这一策略能够灵敏且快速地检测miR-135b（一种胃癌（GC）的生物标志物），其检测限（LOD）为1.4 pM，检测时间仅需2小时。KEY-FACT具有目标miRNA的特异性，适用于人体血清等体液样本（回收率95.2% < 104.3%，变异系数≤13%）。由于其简单的探针设计，KEY-FACT也能用于检测另一种胃癌生物标志物miR-21，且灵敏度相当（LOD = 1.5 pM）。该平台所需仪器极少，因此能够实现经济高效、可现场应用的检测，为实用的按需miRNA诊断铺平了道路。
引言
癌症仍然是全球最严重的健康挑战之一，导致全球范围内大量的发病率和死亡率（Collaboration 2019；Gopal and Sharpless 2021）。2020年，美国约有174万人患有癌症，56.8万人因此死亡。根据人口增长和趋势调整后的模型预测，到2040年，癌症发病率预计将达到约188万人（Rahib et al. 2021）。由于人口老龄化、不健康的生活方式以及环境因素的影响，癌症发病率的上升凸显了开发有效早期诊断和定期监测方法的紧迫性（Belpomme et al. 2007；Irigaray et al. 2007；Matsuda et al. 2025）。及时诊断可以显著改善患者预后，提高治疗效果，并最终降低医疗成本和患者负担。
血液、尿液和脑脊液（CSF）等体液是进行按需癌症诊断的便捷样本（Pagès et al. 2022；Siravegna et al. 2017）。与组织不同，这些样本侵入性小，可重复采样，并通过收集抗原、表观遗传改变、长链非编码RNA和微小RNA（miRNAs）等生物标志物的信息来反映肿瘤的动态变化（Anfossi et al. 2018；Kanda and Kodera 2015；Patel et al. 2017）。miRNAs是一种小型非编码RNA分子（约22个核苷酸），参与基因表达的转录后调控，在生物体液中具有稳定性；其特异性异常表达可以指示癌症类型和阶段（Adams et al. 2014；Lin and Gregory 2015；Xi et al. 2007）。这些特性使miRNAs成为监测癌症的强大生物标志物。
针对miRNA的检测方法有多种，如Northern blotting、流式细胞术、微阵列和实时逆转录聚合酶链反应（RT-qPCR），这些方法都致力于实现高灵敏度和准确性，其中一些已在专业机构（如医院、诊断研究实验室）得到常规应用（Git et al. 2010；Porichis et al. 2014；Pritchard et al. 2012）。其中，RT-qPCR因使用便捷而得到广泛使用。然而，miRNA序列较短，与RT-qPCR的兼容性较差。为保留引物结合位点，通常需要先进行3’-poly腺苷化处理。后续反应需要精确的温度控制和信号采集，这迫使人们使用体积庞大且昂贵的设备。
等温扩增技术作为一种替代方案应运而生，这些技术可在恒定温度下进行，包括链置换扩增（SDA）、环介导的等温扩增（LAMP）、重组酶聚合酶扩增（RPA）和滚环扩增（RCA）（Mohsen and Kool 2016；Notomi et al. 2000；Piepenburg et al. 2006；Walker et al. 1992）。这些技术通过巧妙的设计和核酸修饰酶的帮助，能够有效扩增短miRNA靶标（Deng et al. 2017；Kim et al. 2021；Song et al. 2022），无需预先进行poly腺苷化处理。
CRISPR/Cas系统的引入进一步提高了检测的灵敏度和特异性，因为它利用了引导RNA（gRNAs）识别目标序列后产生的附带切割活性（或跨切割活性）（Chen et al. 2018；Chi et al. 2022；Guo et al. 2023；Kellner et al. 2019；Lee et al. 2024；Qu et al. 2025；Song et al. 2024；Xia et al. 2024；Zhu et al. 2023）。gRNA特异性结合到上游检测流程产生的扩增子目标位点，激活Cas13a对报告探针的附带切割活性，从而增强检测信号。这种简化流程的同时提升性能的做法，激发了研究人员将miRNA检测应用于即时检测（POC）场景的设想。然而，这些系统仍依赖于昂贵的实验室设备，如微孔板读取器、实时PCR机和分光光度计，这限制了现场信号读取的可行性。
为克服这一障碍，研究人员引入了智能手机作为测量工具（Baker et al. 2025；Huang et al. 2019；Yu et al. 2014）。智能手机具有内置的光学传感器和计算能力，便于与检测流程集成。然而，其信号易受外部干扰（如环境光、电气噪声）的影响，不同设备之间的信号读数可能存在差异，影响可靠性和标准化（Baker et al. 2025；Fu et al. 2024）。因此，大多数相关进展仍停留在研究原型阶段。一个实际的突破将是重新利用市售设备。这些设备已在公共领域得到验证，将其用于测量可以加快开发进度、降低成本并确保高可靠性及用户接受度。一旦开发完成，现有的分销网络将有助于这些检测系统在医疗领域的普及。
基于这一策略，我们描述了一种新型的即时miRNA检测系统“KEY-FACT”（基于激酶集合体的燃料辅助CRISPR激活下的葡萄糖磷酸化）。该系统通过等温的燃料辅助CRISPR激活（FACT）过程，随后由激酶集合体（MK、PK和HK）驱动反应产物，引发葡萄糖水平变化。个人血糖仪（PGM）用于读取信号。具体而言，目标miRNA会反复释放被阻断的gRNAs，这些RNA分子可编程Cas13a识别互补的目标序列；但在初始状态下，它们通过与阻断链的杂交而失活。借助燃料的作用，设计的一种特殊链（TMSD）会引发链置换反应，重新生成活性gRNAs，从而激活多个Cas13a酶。激活的Cas13a选择性切割嵌合报告探针中的磷酸二核苷酸键（5’-PO4-auTCCCA-3’；小写表示RNA，大写表示DNA），特别是在riboadenosine-ribouridine（a-u）基序处，释放2’,3’-环腺苷单磷酸（cAMPs）（Gootenberg et al. 2018）。正如我们之前的研究所示（Park et al. 2022），T4 PNK和激酶集合体通过循环磷酸化/去磷酸化反应促使cAMP大量消耗葡萄糖。用户可以立即使用PGM在现场分析目标miRNA。我们使用miR-135b作为模型目标验证了KEY-FACT的检测效果，该miRNA的表达水平与胃癌（GC）的发生和炎症相关（Han et al. 2019）。由于KEY-FACT的探针设计简单，我们进一步将其扩展到检测另一种胃癌生物标志物miR-21（Sekar et al. 2016；Wu et al. 2015）。这种可扩展性和现场分析能力的结合，使按需癌症管理变得更加现实。
KEY-FACT的机制与传统基于CRISPR的PGM平台不同，后者依赖于直接的CRISPR激活、 invertase固定-释放策略或上游核酸扩增来实现足够的灵敏度（Li et al. 2025）。KEY-FACT结合了燃料驱动的gRNA再生和激酶集合体介导的葡萄糖磷酸化级联反应，实现了无需传统酶促反应的目标循环利用，并引入了双层信号传播机制，从而提高了灵敏度。这种设计扩展了基于CRISPR的PGM系统的应用范围，超越了传统的附带切割触发信号转换方式，实现了模块化、无需核酸扩增的检测策略。
KEY-FACT的总体方案和可行性
KEY-FACT反应利用燃料帮助gRNAs在目标miRNA的作用下激活Cas13a。KEY反应通过激酶集合体介导的一系列磷酸化/去磷酸化反应驱动葡萄糖消耗。一种特殊设计的嵌合报告探针（序列见表S1）在T4 PNK的帮助下连接FACT和KEY反应（图1）。最初，gRNA被一对阻断链（blocker-1和blocker-2）捕获。
结论
我们开发了KEY-FACT，这是一种新型的即时miRNA检测系统，它结合了燃料辅助的CRISPR/Cas13a激活（FACT反应）和激酶集合体介导的葡萄糖消耗（KEY反应）。这种巧妙设计的PGM报告探针在CRISPR激活后会发生酶促转化，从而触发葡萄糖消耗，实现现场miRNA检测。与传统基于PGM的方法不同（表S2）……
实验部分
实验部分的详细内容见补充信息中的“S1. 实验部分”。
CRediT作者贡献声明
：资源准备、方法学设计、实验实施。
：写作、审稿与编辑、实验设计、概念构建。
：写作、审稿与编辑、实验设计、概念构建。
：资源准备、方法学设计、实验实施。
：写作、审稿与编辑、初稿撰写、项目管理、资金获取、数据整理、概念构建。
：写作、审稿与编辑、实验设计、概念构建。
利益冲突
作者声明没有利益冲突。
竞争利益声明
作者声明没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了韩国政府（MSIT）资助的NRF和NST项目（RS-2025-00553546、2023R1A2C2005185、RS-2024-00348576、RS-2024-00459749、RS-2025-00554718、2020R1A5A1018052和GTL25061-000）、韩国政府（MOTIE）资助的KEIT项目（RS-2022-00154853、RS-2024-00432382和RS-2024-00403563）、韩国政府（MOHW）资助的KHIDI项目（RS-2025-02213315）、韩国政府（MAFRA）资助的IPET项目（RS-2024-00401639）以及KRIBB研究计划（KGM1322511）的支持。
