《Biosensors and Bioelectronics》：Detection of single nucleotide variants in nucleic acid biomarkers using Raman spectroscopy
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单碱基变体检测新方法：基于5-乙炔基尿嘧啶的拉曼光谱技术实现DNA中SNV的特异性识别，通过氢键相互作用调控的乙炔伸缩振动频率差异实现A/T/G/C的区分，为核酸诊断成像提供新工具。
罗曼·霍隆布（Roman Holomb）|胡伊·范·阮（Huy van Nguyen）|弗朗西娅·阿拉布什（Francia Allabush）|亚历克斯·S·奎（Alex S. Quy）|阿蒂拉·西克（Attila Sik）|费伦茨·穆勒（Ferenc Müller）|拉斯洛·希米茨（László Himics）|塔马斯·瓦奇（Tamás Váczi）|詹姆斯·H·R·塔克（James H.R. Tucker）|米克洛什·韦雷斯（Miklós Veres）|约翰·S·福西（John S. Fossey）
匈牙利国家研究中心（HUN-REN）维格纳物理研究中心固体物理与光学研究所，康科利-特赫格·米克洛什路29-33号，布达佩斯，1121，匈牙利
摘要
单核苷酸变异（SNVs），包括单核苷酸多态性，是许多人类疾病（包括癌症）的关键生物标志物，而在单个位点准确检测这些变异仍然是一个重大的诊断挑战。基于成像的核酸分析方法需要高度特异性的、非荧光的读出策略。在这里，我们报道了一种利用炔基标记核苷酸进行单核苷酸区分的拉曼光谱方法。从头算计算预测，并通过拉曼测量证实，5-乙炔基尿嘧啶的炔基伸缩振动对其互补核苷酸的氢键相互作用非常敏感。将这种结构单元作为5-乙炔基-2'-脱氧尿苷整合到寡核苷酸探针中，可以通过高分辨率拉曼光谱检测目标DNA链中的特定核苷酸。不同的拉曼位移允许区分单核苷酸变异，包括临床上相关的BRAF突变。这些结果表明，炔基标记的探针为单核苷酸分辨率下的SNV检测提供了可靠的拉曼读出方法，为未来的核酸诊断和成像应用奠定了基础。
引言
传统的拉曼光谱基于光子的非弹性散射，可用于识别分子振动，产生特征性的拉曼信号。然而，将这种方法直接应用于生物技术（Morais等人，2020；Vlasov等人，2020）作为普遍使用的电子光谱（例如紫外-可见（UV–Vis）和荧光光谱）的替代方法，受到两个因素的显著限制。首先，生物样本中大多数官能团的拉曼截面较低，导致灵敏度低；其次，由于样本复杂性，特征性的振动拉曼带往往有较高的光谱重叠。第一个限制可以通过表面增强拉曼光谱（SERS）（Laing等人，2016）、相干反斯托克斯拉曼散射（CARS）（Camp Jr等人，2014；Yampolsky等人，2014）和受激拉曼散射（SRS）（Ozeki等人，2012）等技术在一定程度上克服。其中后两种技术对于拉曼成像具有很大的潜力。在SERS的情况下，利用纳米结构中的等离子体效应增强拉曼信号，在单分子检测和生物大分子的定量分析方面显示出显著潜力。最近的研究广泛探索了使用SERS进行无标记DNA检测，包括在单碱基水平上分析核苷酸序列组成（Dubey等人，2021；Huang等人，2019；Johnson等人，2012；Morla-Folch等人，2016）。这些方法由于其无标记的特性而具有灵敏度和简单性的关键优势。尽管如此，除了在实现可重复性和确保实际应用适用性方面存在挑战外，样本复杂性仍然是一个主要问题，因为特征性散射带仍可能严重重叠，阻碍了特定分子及其相互作用的识别和监测。
解决样本复杂性问题的一个方法是使用外源性官能团作为附着在生物探针上的拉曼标签。该标签应产生不与其他系统中的带重叠的带，并且具有相对较大的拉曼截面。炔基在这方面是合适的候选者，因为它们不仅具有相对较大的拉曼截面，而且在自然系统中的含量非常低，这最小化了背景噪声并提高了灵敏度。此外，它们的特征拉曼带频率位于所谓的“无声光谱区域”（通常为1800 – 2800 cm-1），在该区域没有其他振动的贡献（Yamakoshi等人，2011）。它们的小尺寸也比相对较大的荧光标签具有优势，在这些标签可能对所研究的天然生物或生化过程产生不利影响的系统中尤其如此。综上所述，这些属性加上它们作为点击化学试剂的广泛商业可用性，使得炔基成为生物学和医学中各种拉曼成像实验的可行生物正交标签（Yamakoshi等人，2012；Bakthavatsalam等人，2021），包括在活细胞内识别生物分子（Radwan等人，2022）。最近的研究进一步扩展了基于炔基标记的生物分子在拉曼成像中的应用范围，展示了在SRS显微镜中可视化炔基标记的生物分子（Hong等人，2014），通过炔基的同位素替代实现的多路拉曼成像（Egoshi等人，2021），以及使用炔基连接的寡脱氧核苷酸通过SERS同时检测DNA和RNA目标（Watanabe等人，2023）。尽管取得了这些进展，但使用拉曼伸缩频率的变化（而不是信号增强）来监测分子水平上的动态或可逆相互作用的例子仍然很少。无论研究的系统是生物的还是非生物的，或者感兴趣的特定相互作用是分子内的还是分子间的，都是如此。在一个例子中，由于构象变化和离子配对引起的分子振动性质的变化可以通过拉曼光谱读出（Holomb等人，2008）。在另一个最近的例子中，针对可切换SRS显微镜开发的基于炔基的光敏拉曼探针的研究表明，炔基伸缩振动频率对涉及环光环化的邻近共价键的形成非常敏感（Ao等人，2021）。
鉴于这些发现，我们假设以H键介导的DNA碱基配对形式的特定非共价超分子相互作用可以通过邻近炔基团的拉曼伸缩频率变化来读出。在这里，我们报告了对炔基修饰的尿嘧啶核苷酸5-乙炔基尿嘧啶的从头算研究，以及随后使用标准自动化合成将其作为拉曼活性标签整合到两个DNA探针序列中的过程。我们研究了DNA双链形成对标签乙炔振动频率的影响，从而首次证明了拉曼光谱不仅可以用于检测H键连接的碱基对的形成，还可以用于识别目标DNA链中标签位点对面的特定核苷酸（即 A、T、G或C）。后者对于诊断非常重要，因为单核苷酸变异（SNVs，包括单核苷酸多态性或SNPs）在核酸序列中是多种人类疾病（如阿尔茨海默病和某些类型的癌症）的生物标志物（Karki等人，2015；Hart等人，2015；Price等人，2015；Guo等人，2005）。因此，我们的发现为高特异性和高灵敏度检测SNVs的研究铺平了道路，为将我们的检测方法实际应用于包括诊断在内的各种生物医学应用奠定了基础。
章节片段
寡核苷酸合成与分析
所有试剂和溶剂均按供应商的指示直接购买和使用，无需进一步纯化。Pac-dA、iPr-Pac-dG、Ac-dC、dT的标准磷酰胺购自LGC Genomics。5-乙炔基-dU-CE磷酰胺购自Glen Research。HPLC级溶剂购自Fisher Scientific。寡核苷酸在Applied Biosystems ABI 394上合成。半制备型HPLC纯化在Agilent Technologies 1260上进行
计算含有炔基修饰核苷酸的H键连接碱基对的炔基拉曼带位置
据我们所知，目前还没有关于使用拉曼光谱来检测或监测由H键相互作用介导的离散超分子复合物形成的报告。鉴于其在控制核酸碱基配对中的基本作用，我们选择了DNA和RNA中都存在的典型沃森-克里克碱基配对作为模型系统进行研究。每个核苷酸都选择了一个直接与嘌呤（E1-G，E1-A）或嘧啶（E1-U）共轭的乙炔基团
结论
首次，基于原子尺度的建模和理论计算，结合实验拉曼测量，揭示了炔基伸缩振动对以氢键形式存在的超分子相互作用的敏感性。特别是，标记的尿嘧啶核苷酸5-乙炔基尿嘧啶的炔基带频率取决于形成的碱基对的身份，从而能够在DNA双链中区分匹配和不匹配的碱基对。
CRediT作者贡献声明
拉斯洛·希米茨（László Himics）：撰写——原始草稿，研究。约翰·S·福西（John S. Fossey）：方法学，概念化。米克洛什·韦雷斯（Miklós Veres）：撰写——原始草稿，监督，概念化。塔马斯·瓦奇（Tamás Váczi）：撰写——原始草稿，研究。詹姆斯·H·R·塔克（James H. R. Tucker）：撰写——原始草稿，方法学。弗朗西娅·阿拉布什（Francia Allabush）：研究。亚历克斯·S·奎（Alex S. Quy）：研究。罗曼·霍隆布（Roman Holomb）：撰写——原始草稿，研究，形式分析。胡伊·范·阮（Huy van Nguyen）：研究。阿蒂拉·西克（Attila Sik）：概念化。费伦茨·穆勒（Ferenc Müller）：
未引用的参考文献
Cekan和Sigurdsson，2008；Guo和Jamison，2005；Inouye等人，2005；McLean和Chandler，1980；Pujol，2007；Saito和Hudson，2018；Shamsi和Kraatz，2013。
数据可用性
支持本文的数据已作为补充信息的一部分包含在内。
利益冲突声明
? 作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系：米克洛什·韦雷斯报告称获得了欧盟的财务支持。如果有其他作者，他们声明没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。
致谢
本文献给2022年4月去世的约翰·福西教授。约翰是这项工作的推动力，他在多个方面起到了激励性导师、同事和合作者的作用。
作者感谢伯明翰大学化学学院的化学与材料分析中心。本文中描述的计算使用了伯明翰大学的BlueBEAR HPC服务，该服务提供了高
