基于血红蛋白的高通量评估方法用于评价冷冻保护剂的效力

《Cryobiology》：Hemoglobin-based high-throughput assessment of lyoprotectant efficacy

血红蛋白氧化测试被开发为高通量平台用于筛选冻干保护剂，比较了单糖、寡糖和多糖的保护效果，IC50显示海藻糖摩尔浓度最优（2.5±0.5 mM），但质量浓度下各糖类差异不显著（0.12±0.02% w/v）。分子动力学模拟显示大分子糖类通过形成氢键覆盖血红蛋白表面，置换水分形成保护层，协同玻璃化作用维持生物活性。实验-计算整合框架为冻干红血球稳定剂设计提供定量机制指导。

　　

摘要

生物制品，包括疫苗、治疗性蛋白质、血液制品和细胞疗法，在干燥过程中容易发生降解，因此需要在加工配方中添加保护性添加剂（冻干保护剂），以在复溶后保持其所需的生物活性。然而，用于定量评估冻干保护剂效果的检测方法仍然有限。本文开发了一种血红蛋白氧化检测方法，将其转化为一种高通量平台，用于筛选化合物在冻干过程中的保护性能。血红蛋白是一种对氧化还原反应敏感的蛋白质，在干燥和复水过程中会发生氧化，这为检测干燥引起的蛋白质变性提供了可靠的指标。通过测量抑制血红蛋白氧化50%所需的糖类和聚合物的浓度（IC₅₀），可以量化它们的保护作用。在比较各种碳水化合物时，基于摩尔浓度的结果表明岩藻糖具有最强的保护效果（IC₅₀ = 2.5 ± 0.5 mM），但基于质量浓度（% w/v）时，不同碳水化合物之间的IC₅₀值几乎没有差异（IC₅₀ = 0.12 ± 0.02 % w/v）。为了补充实验结果，还进行了在含葡萄糖、海藻糖和岩藻糖条件下血红蛋白的全原子分子动力学模拟。模拟显示，较大的碳水化合物能与血红蛋白形成更多的氢键，并在其表面更广泛地积累，从而在冷冻过程中取代水分子，形成保护性“涂层”。这些结果表明，水的替代和表面覆盖是糖类在干燥过程中稳定生物制品的主要机制，可能与玻璃化过程协同作用。这种结合实验和计算的方法为评估、改进冻干保护剂的设计以及优化冻干红细胞的稳定剂提供了定量且基于机制的理解。

引言

像细胞和基因疗法、疫苗以及血液衍生产品这样的生物制品在水性制剂中本质上是不稳定的，需要小心处理和冷链储存以保持其功能完整性[3, 20, 40, 41]。干燥技术，特别是冻干（冷冻干燥）和喷雾干燥，通过允许在常温下长期储存生物制品，为这一挑战提供了有效的解决方案[8, 10, 38]。这种保存技术对医疗保健领域具有重要意义，尤其是在资源有限的环境中、全球疫苗分配、紧急储备，甚至太空医学中，这些地方可能无法实现冷藏[18, 49]。通过去除水分同时保持分子稳定性，干燥不仅延长了保质期，还增强了生物疗法的韧性和便携性[45]。

为了在干燥过程中保护生物结构和功能，加工配方中会添加称为冻干保护剂的特殊化合物（即稳定剂、脱水保护剂、异质保护剂），这些化合物可以稳定蛋白质、膜和其他细胞成分[48]。二糖如海藻糖和蔗糖是生物制药行业中使用最广泛的冻干保护剂之一[5]。它们的保护作用归因于几种机制：（1）它们可以在干燥条件下替代通常由水介导的氢键相互作用（水替代假说；热力学稳定性）；（2）通过形成无定形玻璃状基质来降低分子流动性（动力学稳定性）；（3）在水合状态或干燥过程中优先排除生物大分子（热力学稳定性）[13, 14, 31]。虽然甘油和二甲基亚砜等冷冻保护剂在冷冻过程中有效，但它们的玻璃化转变温度低、化学反应性强且具有细胞毒性，因此不适合用于干燥状态下的保存[39]。这些局限性凸显了需要专门优化以在无水状态下稳定生物分子的保护剂。除了糖类之外，还包括氨基酸、多元醇和内在无序蛋白质在内的多种替代冻干保护剂也在被探索中，因为它们具有独特的保护性能[22, 23, 47]。

尽管冻干保护剂在生物制品保存中起着核心作用，但目前仍缺乏能够快速评估其保护能力的定量、生物学上有意义的检测方法。大多数现有方法依赖于间接或二元指标，如干燥和复水后的蛋白质溶解度或酶活性，这些方法往往无法捕捉到微妙的氧化或结构损伤。血红蛋白是一种特性明确且对氧化敏感的蛋白质，为优化冻干保护剂配方提供了一种有前景的新方法。血红蛋白的氧化还原状态可以通过分光光度法轻松监测，其对干燥引起的氧化的敏感性使其成为评估氧化应激和蛋白质损伤的理想指标。通过量化候选化合物在干燥过程中抑制血红蛋白氧化的程度，我们可以建立剂量-反应曲线并计算冻干保护剂的半最大抑制浓度（IC₅₀），即干燥和复水后一半的血红蛋白受到保护的浓度。这种检测方法为筛选化合物的冻干保护潜力提供了标准化、可扩展的框架。此外，这种方法有助于识别支持冻干红细胞（RBC）长期储存的冻干保护剂，因为已知血红蛋白氧化是干燥过程中的主要损伤来源[28, 34]。

为了补充实验检测并深入了解冻干保护剂与血红蛋白之间的相互作用，进行了全原子分子动力学（MD）模拟。这些模拟使我们能够检查低温下碳水化合物在血红蛋白附近的空间组织和氢键模式。关于碳水化合物提供保护机制的现有理论，包括优先排除和水替代假说，对保护剂在蛋白质界面上的行为做出了具体预测[14, 31]。例如，优先排除模型预测糖类在热力学上会被排除在蛋白质表面的直接邻近区域之外。这种排除增加了 unfolded 状态相对于 native 状态的化学势，从而在不需要保护剂与蛋白质直接相互作用的情况下稳定了折叠构象。水替代假说认为糖类会取代水分子并在蛋白质表面形成直接的氢键。MD 模拟提供了一种强大的方法，在 计算机模拟 中研究这些机制，通过量化氢键网络、溶剂可及性和保护剂的原子级接近程度。需要注意的是，这些假说并不互相排斥，保护机制可能取决于可用的水分。

通过模拟不同碳水化合物存在下的血红蛋白分子相互作用，我们确定了这些分子是被优先排除还是直接与蛋白质表面相互作用，以及这些相互作用如何与干燥状态下的保护效果相关联。这些模拟使我们能够追踪特定残基的氢键形成情况，评估结构扰动，并探讨保护剂的分子大小和流动性如何影响其在血红蛋白周围的空间分布。将 MD 模拟与实验得到的 IC₅₀ 数据相结合，提供了冻干保护剂作用的全面图景，将宏观结果与分子层面的机制理解联系起来。

章节片段

化学物质

低内毒素 α,α-海藻糖二水合物从 Pfanstiehl Inc.（伊利诺伊州沃基根）获得，L-阿拉伯糖从 Beantown Chemical（新罕布什尔州哈德逊）购买，甲基 α-D-吡喃糖苷、甘油醛和 1,3-二羟基丙酮从 AmBeed（伊利诺伊州布法罗格罗夫）购买。所有其他化合物均从 Avantor（宾夕法尼亚州拉德诺）、Thermo Fisher Scientific（马萨诸塞州沃尔瑟姆）或 Millipore Sigma（马萨诸塞州伯灵顿）购买，均为市场上纯度最高的商品。用于溶液的化学物质

海藻糖在干燥过程中对血红蛋白氧化的抑制作用具有剂量依赖性

在 0% 相对湿度条件下，血红蛋白在冻干和常压干燥过程中会发生显著氧化（图 3A 和图 S1）。冷冻和解冻后 % OxyHb 没有显著变化，然而，在干燥和复水后高铁血红蛋白（约 60% 的氧化）显著增加，表明干燥和可能的复水是氧化损伤的主要驱动因素（p < 0.05）（图 3A）。为了建立血红蛋白保护的机制基准

讨论

研究结果强调了冻干过程中冻干保护剂浓度相对于蛋白质含量的重要性，这对于确定其对血红蛋白氧化的保护效果至关重要。干燥过程中血红蛋白 heme 的氧化抑制受到血红蛋白浓度的影响，这突显了根据保护剂与目标蛋白质之间的化学计量比或质量比来解释保护效果的重要性。值得注意的是，需要高摩尔过量的

CRediT 作者贡献声明

Charles A. Elder：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，监督，项目管理，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。Ivan Klbik：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原始草稿，可视化，验证，资源管理，方法学，研究，资金获取，正式分析，数据管理，概念化。Ali M. Alkafaji：撰写 – 原始草稿，可视化，验证，

利益声明

共同作者 M.A.M. 和 J.A.K. 持有一家涉及红细胞冻干技术的初创公司的股权。

致谢

本工作得到了 美国陆军医学研究采购活动 (USAMRAA) 的支持，资助编号为 HT9425-24-1-0600 和 W81XWH-20-1-0866。部分研究成果使用了在国家项目 国家高性能计算能力中心（项目代码：p1349-25-2）中获得的计算资源，该项目由 欧洲区域发展基金、欧盟结构基金 和 综合运营计划 资助