《Chemico-Biological Interactions》：β-Nicotinamide Mononucleotide Prevents Senescence and Lipid Accumulation in Hepatic Stellate Cells by Restoring SIRT1 Function
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肝星状细胞（HSCs）活化参与肝脏修复，但过度活化导致纤维化及癌症。本研究发现脂质过氧化产物4-羟基-2-烯醛（HNE）和4-氧代-2-烯醛（ONE）可诱导HSCs衰老，而NAD+前体NMN预处理显著抑制此过程，通过改善线粒体膜电位、恢复SIRT1活性及调节脂质代谢实现，提示NMN可能成为抗HSCs衰老策略。
作者：坂智文（Tomofumi Saka）、林里里（Riri Hayashi）、吉野雄太（Yuta Yoshino）、水井泰一（Taichi Mitsui）、丸山宏（Hiroe Maruyama）、河口光之（Hiroyuki Kono）、中川英彦（Hidehiko Nakagawa）、生垣明（Akira Ikari）、远藤智（Satoshi Endo）
日本岐阜县岐阜市岐阜药科大学生物化学实验室，邮编501-1196
摘要
肝星状细胞（HSCs）的激活在肝脏伤口愈合中起着至关重要的作用，包括肝脏再生和修复。然而，随着持续激活，衰老细胞的增加，细胞外基质、胶原蛋白、转化生长因子-β以及其他细胞因子的分泌也会增加，从而导致肝纤维化、肝硬化和肝癌。本研究探讨了脂质过氧化产物醛类（LPDAs），如4-羟基-2-壬烯醛（HNE）和4-氧代-2-壬烯醛（ONE）（这些物质会随着年龄增长而积累）对HSC衰老的影响。此外，还研究了烟酰胺单核苷酸（NMN）的抑制作用，NMN是NAD+的前体，也是抗衰老因子sirtuin 1（SIRT1）的辅因子。在LX-2细胞中，HNE和ONE显著增加了与衰老相关的分泌表型因子基因的表达以及SA-βGal的活性。NMN预处理可以抑制HNE诱导的细胞衰老。NMN预处理显著降低了Bax/Bcl2比率，表明线粒体外膜通透性降低，并恢复了线粒体膜电位。NMN预处理还恢复了HNE处理后下降的SIRT1蛋白表达和酶活性。此外，NMN预处理逆转了HNE引起的脂质代谢酶表达下降，并增加了细胞内脂质含量。总之，NAD+前体NMN抑制了LPDAs诱导的HSC衰老。其机制可能与线粒体膜电位的改善、细胞内NAD+水平的恢复以及脂质积累的改善有关。这些发现表明，NMN可能有助于开发针对HSC相关病理的新抗衰老策略。
引言
衰老是心血管疾病、肝脏疾病、高脂血症和恶性肿瘤发展的最关键风险因素之一。近年来，细胞衰老作为衰老过程的重要组成部分受到了关注。细胞衰老是指细胞不可逆地进入生长停滞状态[1]。衰老细胞通过分泌多种称为衰老相关分泌表型（SASP）因子的物质来维持细胞稳态，这些因子包括炎症细胞因子、趋化因子和生长调节因子[2]。然而，由于衰老细胞的积累，SASP因子的过度和持续释放会导致持续的炎症反应[3]。这种炎症反应的长期存在会导致与非酒精性脂肪肝病（NAFLD）和肾衰竭等与衰老相关的疾病的发展和进展[4][5]。据估计，NAFLD影响了约10亿人[6]。NAFLD包括非侵袭性非酒精性脂肪肝（NAFL）和进行性非酒精性脂肪性肝炎（NASH），后者可能因炎症和纤维化从NAFL发展为NASH，最终导致肝癌[7]。肝星状细胞（HSCs）在肝脏伤口愈合中起着重要作用，包括肝脏再生和修复，在肝脏受损时它们会被激活并分化为成纤维细胞[8]。然而，激活的HSCs数量增加会导致细胞因子和细胞外基质成分（如胶原蛋白和转化生长因子-β）水平升高，最终导致肝纤维化、肝硬化和肝癌[9]。因此，针对HSC的衰老是一个预防肝纤维化和癌症的关键策略。细胞不断产生活性氧（ROS），如过氧化氢和羟基自由基。由于过量的ROS会损害细胞，细胞内的ROS浓度通过内源性抗氧化机制（包括抗氧化酶和谷胱甘肽等抗氧化剂）维持在较低水平[10]。过量的ROS会导致蛋白质的氧化修饰、DNA的甲基化损伤以及细胞膜的脂质过氧化。脂质过氧化会产生各种副产物，包括醛类和其他有毒物质。在脂质过氧化产物醛类（LPDAs）中，4-羟基-2-壬烯醛（HNE）和4-氧代-2-壬烯醛（ONE）通过与DNA和蛋白质的Michael加成反应表现出高细胞毒性[11][12]。由于它们会随着年龄增长而积累并破坏氧化还原平衡，HNE和ONE被认为是衰老标志物[13]。相反，有研究表明LPDAs本身可以诱导皮肤成纤维细胞和血管内皮细胞的衰老[14][15]。然而，它们对HSC衰老的影响仍知之甚少。
近年来，衰老研究取得了显著进展。提出了多种抗衰老策略，包括热量限制、清除衰老细胞、重编程和抗氧化[16]。烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD+）的补充疗法受到了广泛关注，NAD+作为氧化反应中的辅因子而广为人知[17]。NAD+对生物体的生存至关重要，在氧化磷酸化过程中起核心作用，但其水平会随年龄增长而下降[18]。提高细胞内的NAD+水平可以延缓小鼠模型的衰老[19]，恢复肌肉功能[20]，促进大脑中的神经再生[21]，并提供对代谢疾病的保护。然而，NAD+的细胞膜通透性极低，简单的补充不足以发挥作用[22]。因此，烟酰胺单核苷酸（NMN）作为NAD+的前体，作为一种具有抗衰老效果的保健食品成分而受到关注。NMN是NAD+的中间代谢物，在哺乳动物体内由烟酰胺和烟酰胺核糖（NR）生成[23]。NMN可以穿透细胞膜，并在进入细胞后迅速转化为NAD+[24]。尽管已经进行了多项关于NMN抗衰老效果的研究，但对其对HSC衰老的影响知之甚少。在本研究中，我们探讨了NMN对人类肝星状LX-2细胞中LPDAs诱导的衰老的影响。
材料
HNE和ONE购自Cayman Chemicals（美国密歇根州安娜堡），NMN由API Corporation（日本岐阜）提供。SRT2104和Selisistat购自Selleck Chemicals（美国德克萨斯州休斯顿）。所有其他化学品均为市售最高等级的产品。
细胞培养
人类肝星状LX-2细胞购自Merck Millipore（美国新泽西州肯尼尔沃思），并在添加了5%成分的Dulbecco改良Eagle培养基（DMEM，富士胶片Wako Pure Chemical，日本大阪）中培养
LPDAs在肝星状LX-2细胞中诱导衰老
我们研究了HNE和ONE是否会在LX-2细胞中诱导衰老。当用HNE或ONE处理细胞72小时后，浓度超过2 μM时观察到细胞活力逐渐下降（图1A，B）。10 μM的HNE处理虽然略微降低了细胞活力，但增加了SA-βGal的活性（图1C）。除了细胞周期停滞和SASP因子的释放外，形态变化和染色质重组也是细胞衰老的关键特征[28]（图1D）。
讨论
在这项研究中，我们首次证明了NAD+前体NMN可以抑制HNE诱导的HSC衰老。细胞衰老诱导过程中细胞周期的稳定停滞涉及p53/p21和/或p16/磷酸化视网膜母细胞瘤（pRB）肿瘤抑制途径的激活[38][39][40]。同时，还会发生形态变化，包括细胞增大和核层蛋白组成的改变。
CRediT作者贡献声明
丸山宏（Hiroe Maruyama）：撰写、审阅和编辑。
水井泰一（Taichi Mitsui）：撰写、审阅和编辑、实验研究。
吉野雄太（Yuta Yoshino）：撰写、审阅和编辑。
林里里（Riri Hayashi）：数据可视化、实验研究。
坂智文（Tomofumi Saka）：初稿撰写、数据可视化、实验研究、数据管理。
远藤智（Satoshi Endo）：初稿撰写、监督、数据管理、概念构思。
生垣明（Akira Ikari）：撰写、审阅和编辑。
中川英彦（Hidehiko Nakagawa）：撰写——
利益冲突
作者声明以下利益冲突：
•本研究中使用的NMN由API Corporation（日本岐阜）提供。
•本研究部分得到了API Co., Ltd.（日本岐阜）的合作研究资助。
•三位共同作者水井泰一、丸山宏和河口光之隶属于API Co., Ltd.的Nagaragawa研发中心。
其余作者声明没有利益冲突。
利益冲突声明
? 作者声明他们没有已知的可能会影响本文报告工作的财务利益或个人关系。
致谢
本研究部分得到了API Co., Ltd.（日本岐阜）的合作研究资助。
