综述：CRISPR-Cas12a/Cas13a在癌症分子诊断中的应用

《Clinica Chimica Acta》：CRISPR-Cas12a/Cas13a in cancer molecular diagnosis

液体活检中CRISPR-Cas12a/Cas13a系统通过高灵敏度和可多重检测的特性，解决了传统方法成本高、标准化差等问题，为癌症分子诊断提供新工具，但需克服PAM依赖、基质干扰等挑战。

Juncheng Lin|Yuyuan Wang|Biyun Zeng|Zhibing Chen|Xiaocong Lin|Tao Zeng

广东医科大学医学技术学院，中国广东省东莞市523808

摘要

癌症仍然是全球主要的死亡原因之一，早期诊断对于改善治疗结果至关重要。传统的组织活检方法存在侵入性、无法捕捉肿瘤异质性以及无法支持动态监测等局限性。液体活检作为一种非侵入性替代方案应运而生，能够分析体液中的循环肿瘤生物标志物（如ctDNA、miRNAs、外泌体）。然而，目前的液体活检技术（如NGS、ddPCR）存在成本高、工作流程复杂、标准化程度低以及对低丰度生物标志物检测灵敏度不足的问题。CRISPR-Cas系统，尤其是Cas12a和Cas13a，由于其可编程的序列识别能力、通过跨切割/旁路切割实现强大的信号放大效果以及与即时检测（POCT）的兼容性，彻底改变了分子诊断领域。Cas12a能够靶向DNA分子，从而敏感地检测基因突变和DNA甲基化；而Cas13a则专门识别RNA，便于直接分析miRNAs和病毒RNA。此外，这些系统还通过信号转换策略扩展到了非核酸生物标志物（如蛋白质、外泌体）的检测。本文总结了基于CRISPR-Cas12a/Cas13a的生物传感器在癌症分子诊断方面的最新进展，包括基因突变、表观遗传修饰、miRNAs、肿瘤相关病毒和非核酸生物标志物的检测。我们批判性地分析了当前面临的挑战（如PAM依赖性、基质干扰、多重检测限制、临床验证不足等问题），并探讨了未来的发展方向，如开发无需PAM的Cas变体、整合纳米技术、微流控技术和人工智能（AI），以及推进临床标准化。本文旨在为基于CRISPR的癌症诊断技术的发展和临床应用提供全面的参考。

引言

癌症是全球主要的健康威胁，每年导致超过1000万人死亡[1]。早期和准确的诊断对于降低死亡率至关重要，因为它能够实现及时干预和个性化治疗。组织活检长期以来一直是癌症确诊的金标准，但其侵入性可能导致患者不适并引发并发症[2]。此外，组织活检只能提供肿瘤的单一时间点信息，无法反映肿瘤的时空异质性，也限制了对治疗反应或微小残留疾病（MRD）的动态监测[1]。

液体活检通过分析体液（如血液、尿液、粪便）中的循环肿瘤生物标志物（如循环肿瘤DNA（ctDNA）、微RNA（miRNAs）、外泌体和循环肿瘤细胞（CTCs）成为一种革命性的非侵入性诊断工具[2]。它具有重复采样、实时肿瘤分析以及早期检测癌症相关分子变化的优势。然而，液体活检的广泛临床应用受到几个关键限制的阻碍[3]：

• 1.1.
  高昂的成本和复杂的工作流程：下一代测序（NGS）和数字滴液PCR（ddPCR）等技术需要昂贵的设备、专业实验室和熟练的人员，从而限制了资源有限环境中的应用[4]。
• 1.2.
  标准化的缺乏：样本处理、核酸提取和数据分析缺乏统一协议，导致不同平台之间的结果不一致[3]。
• 1.3.
  对低丰度生物标志物的检测灵敏度不足：早期癌症生物标志物（如ctDNA）通常浓度极低（fM-aM水平或变异等位基因频率<1%），超出了传统方法的检测范围[5]。
• 1.4.
  多重检测能力有限：同时检测多种生物标志物（如突变+甲基化+miRNA）较为困难，限制了全面的肿瘤分析[6]。

为了解决这些瓶颈，迫切需要成本效益高、灵敏度高、特异性强且便携的诊断技术，这些技术应符合世界卫生组织提出的“REASSURED”标准（实时性、易用性、经济性、灵敏度、特异性、用户友好性、快速性、无需设备、可交付性）[7]。最初用于基因编辑的CRISPR-Cas系统，由于其可编程的序列识别能力和强大的信号放大能力，已成为分子诊断领域的颠覆性工具[8]。在CRISPR-Cas系统中，Cas12a和Cas13a分别被广泛研究用于癌症诊断，分别针对DNA和RNA生物标志物[9],[10]。本文首先介绍了Cas12a/Cas13a的核心机制（包括结构生物学见解[11]），然后详细阐述了它们在癌症分子诊断中的应用（包括完整的检测平台），分析了当前面临的挑战（重点讨论临床转化障碍[12]），并探讨了未来的发展方向，为基于CRISPR的癌症诊断技术的发展和临床应用提供了全面的参考。

CRISPR-Cas12a/Cas13a系统的核心机制

根据效应复合物的组成，CRISPR-Cas系统分为两大类（第1类和第2类）[8]。Cas12a和Cas13a属于第2类，其特点是仅包含一个效应蛋白，这一特性使它们特别适合用于诊断应用[8]。它们的核心诊断潜力源于独特的“旁路切割”（跨切割）活性，这种活性能够将特定的目标识别转化为可检测的信号[8]

CRISPR-Cas12a/Cas13a在癌症分子诊断中的应用

CRISPR-Cas12a/Cas13a系统经过合理设计，可用于检测多种癌症生物标志物，涵盖基因突变到非核酸分子。这些生物标志物在癌症诊断中各自发挥不同作用：基因突变驱动肿瘤发生并介导药物耐药性，DNA甲基化反映早期表观遗传变化，miRNAs作为稳定的液体活检指标，肿瘤相关病毒是关键的致癌因素，而非核酸

CRISPR-POCT适应性：技术突破

为了满足REASSURED标准，基于CRISPR的诊断系统通过三种核心技术实现了即时检测的适应性：简化样本处理、设备微型化和试剂稳定化[7]：

• 4.1.
  无需RNA提取的技术可以直接检测经过释放剂处理的鼻咽拭子样本，在22分钟内完成SARS-CoV-2的检测，临床一致性达到100%[97]；40微升全血即可直接检测结直肠

当前面临的挑战

尽管取得了显著进展，CRISPR-Cas12a/Cas13a系统在临床应用方面仍面临关键瓶颈：

未来展望

为了实现临床应用，未来的研究应重点关注：

结论

CRISPR-Cas12a/Cas13a系统通过解决传统技术（如NGS、qPCR和ELISA）的长期周转时间、灵敏度有限和动态范围狭窄等关键问题，彻底改变了癌症分子诊断领域[124]。它们的核心优势（可编程序列识别、强大的跨切割信号放大能力和多分析物兼容性）重新定义了临床检测的可行性[8]。技术突破，如Cas

作者贡献

Tao Zeng和Xiaocong Lin构思并设计了这项研究。Juncheng Lin、Yuyuan Wang和Biyun Zeng起草了初稿。Xiaocong Lin审阅并编辑了原始稿件。Juncheng Lin和Yuyuan Wang进行了文献检索。Zhibing Chen负责数据可视化。Tao Zeng和Xiaocong Lin负责资金获取并监督研究，同时担任项目管理员。所有作者均已阅读并批准了最终稿件。数据真实性未经验证

作者贡献声明

Juncheng Lin：撰写——审阅与编辑，撰写——初稿，研究。Yuyuan Wang：撰写——初稿，研究。Biyun Zeng：撰写——初稿。Zhibing Chen：数据可视化。Xiaocong Lin：资源获取，概念构思。Tao Zeng：资源获取，概念构思。

伦理声明

不适用

资助

本研究得到了广东省基础与应用基础研究基金会（资助编号：2023A1515010235）、广东医科大学附属医院高层次人才启动基金（资助编号：51301Z20200007）、广东省医学科学技术研究项目（资助编号：A2023168和B2021180）以及广东医科大学学科建设项目（资助编号：4SG21266P）的资助。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

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