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肝母细胞瘤中 deregulated 的铁死亡转录调控程序与神经元分化相关。通过分析两个转录组队列及单细胞测序数据，发现 51 个基因的铁死亡程序失调，其中 SLC7A11、PRKAA2 等氧化应激相关基因在肿瘤及神经元细胞中显著 upregulated。单细胞分析显示肿瘤神经元细胞铁死亡驱动基因（如 TGFB2、BEX1）与 GRIN2B 神经受体及 LEF1 信号转录因子共调控。研究揭示铁死亡转录异质性可能通过氧化应激响应调控肝母细胞瘤神经元分化，为靶向治疗提供新思路。
Raquel Francés | í?igo Casafont | Christophe Desterke | Jorge Mata-Garrido
坎塔布里亚大学-IDIVAL解剖学与细胞生物学系细胞与组织生物学小组，西班牙桑坦德39011
摘要
背景
肝母细胞瘤是一种罕见的儿童肝癌，主要影响三岁以下的儿童。肿瘤细胞的干性特征与肿瘤复发和治疗耐药性有关。铁死亡（一种程序性细胞死亡）在癌症治疗耐药性中起作用，并受铁代谢和脂质过氧化的影响。
方法：使用ferroviz R包和铁死亡相关转录程序（FerrDb V2），通过监督方法分析了两个独立的肝母细胞瘤转录组数据队列（GSE131329和GSE104766）。进一步通过单细胞RNA测序数据（GSE180665）研究了跨验证的铁死亡失调转录程序，该数据包括正常肝脏、患者来源的异种移植模型和人类肿瘤样本。对肿瘤神经细胞进行了Slingshot伪时间轨迹分析。
结果：在训练队列中，发现89个与铁死亡相关的基因在肝母细胞瘤中失调，其中大多数上调分子参与氧化应激反应和组蛋白修饰（p值=0.0088）。在验证队列中，有96个铁死亡基因失调，包括8个与氧化应激反应相关的上调分子。两个队列之间的交叉验证确定了51个共同特征基因：20个在肝母细胞瘤肿瘤中上调，31个下调。在氧化应激相关分子中，SLC7A11、GPX7、SRC、NQO1、PYCR1和PRKAA2上调。此外，参与羧酸生物合成的基因网络在肿瘤中被抑制。在单细胞水平上，与正常肝细胞相比，肿瘤细胞中下调的铁死亡程序得到证实。相反，上调的铁死亡程序在神经肿瘤细胞中特别活跃，TGFB2、NQO1、PRKAA2、ACSL4、IGF2BP3、BEX1、SLC7A11和SRC上调。在神经细胞中，ACSL4与NQO1、BEX1、SRC和IGF2BP3等铁死亡抑制因子共调节，而TGFB2（表达受限的铁死亡驱动因子）与SLC7A11和PRKAA2共调节。肿瘤神经细胞的伪时间轨迹分析将TGFB2表达与GRIN2B谷氨酸受体和LEF1转录因子的调控相关联。
讨论：本研究确定了在两个独立转录组队列中失调的铁死亡转录程序。在单细胞水平上，这些与氧化应激反应相关的改变揭示了人类肝母细胞瘤肿瘤中神经分化的见解。
引言
肝母细胞瘤是儿童中最常见的原发性肝癌，主要影响三岁以下的儿童（Perilongo等人，2000年）。尽管早期诊断和治疗的进步改善了预后，但由于其复杂的生物学特性和多样的临床表现，这种侵袭性儿童肿瘤仍然具有挑战性。关键的预后标志物，包括肝内肿瘤扩散、血管侵袭、多灶性和远处转移，与不良预后相关（Perilongo等人，2000年）。在分子水平上，肝母细胞瘤与发育信号通路的异常密切相关，特别是WNT/β-连环蛋白通路中的突变，大约90%的病例中观察到这些突变。该通路在维持肝母细胞瘤细胞的干性方面起着关键作用，导致肿瘤的侵袭性和未分化特性（Eichenmüller等人，2014年；Mavila和Thundimadathil，2019年）。
最近的研究强调了铁死亡在肝母细胞瘤生物学中的重要性，铁死亡是一种独特的铁依赖性、活性氧（ROS）介导的细胞死亡形式。与凋亡和自噬不同，铁死亡具有独特的细胞学特征，包括线粒体损伤，如嵴的减少或丧失、外膜破裂和线粒体膜浓缩（Yu等人，2017年；Dixon等人，2012a）。值得注意的是，肝母细胞瘤细胞对铁死亡具有抗性，部分原因是N6-甲基腺苷（m6A）修饰抑制了SLC7A11 mRNA的脱腺苷化。SLC7A11编码一种对谷胱甘肽生物合成至关重要的半胱氨酸转运蛋白，谷胱甘肽是抵抗氧化应激的关键防御机制（Liu等人，2022年）。此外，针对铁死亡的治疗策略显示出希望，依维莫司可诱导肝母细胞瘤细胞中的自噬依赖性铁死亡（Huang等人，2024年）。
新兴证据还表明，肝母细胞瘤肿瘤可以表现出神经内分泌分化，一些研究报道了BEX1等大脑特异性蛋白的共表达，这些蛋白促进了肝母细胞瘤细胞的干性（Wang等人，2023年）。罕见的肝母细胞瘤与神经母细胞瘤同时发生的病例进一步表明这两种肿瘤类型之间存在潜在的分子重叠，这与特定的遗传和临床特征有关（Skoczen等人，2019年）。组织学上，在肝母细胞瘤肿瘤中观察到了神经内分泌特征（Ruck等人，1990年），这表明神经分化可能在肿瘤生物学中起作用。
有人认为铁死亡可能参与神经分化。脊髓损伤（SCI）是一种严重的中枢神经系统问题，通常会导致运动和感觉功能的不可逆失调（Koffler等人，2019年）。在SCI期间，铁过载的逆转可以促进神经干细胞/祖细胞分化为神经元，并激发新生神经元的再生潜力，伴随着轴突重新神经支配和髓鞘再生（Geng等人，2023年）。通过体外神经干细胞模型显示，二甲双胍可以通过调节谷胱甘肽合成和减少活性氧来逆转依拉司汀的治疗效果（Xing等人，2024年）。
在这项研究中，我们探讨了与肝母细胞瘤中铁死亡相关的转录异质性，重点关注神经分化。通过分析两个独立的转录组队列，我们确定了一个涉及51个与铁死亡相关分子的失调转录程序，这些分子主要参与细胞对氧化应激的反应。重要的是，单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据显示，这种铁死亡程序在肿瘤相关神经细胞中比其他肿瘤细胞类型更活跃。具体来说，在神经细胞中鉴定出一个共调节的铁死亡驱动因子网络——SLC7A11、PRKAA2和TGFB2——其作用独立于细胞周期进展。该网络与GRIN2B（神经祖细胞的标志物）和LEF1（与WNT信号通路相关的转录因子）的激活有关。这些发现表明，与铁死亡相关的转录异质性可能在驱动肝母细胞瘤中的神经分化中起作用，为肿瘤的复杂生物学和潜在的治疗脆弱性提供了新的见解。因此，我们假设与铁死亡相关的转录失调塑造了肝母细胞瘤中的神经分化途径，可能将氧化应激反应与肿瘤内的神经发育程序联系起来。
人类肝母细胞瘤肿瘤转录组队列1
使用Hiyama（2019年）描述的转录组数据集GSE131329。该队列包括14个非癌性肝组织样本和53个肝母细胞瘤样本。在患有肿瘤的患者中，有50人在研究过程中去世（表1）。组织学上，30患者的肿瘤分化良好，21患者的肿瘤分化不良。该队列的性别比例均衡，采样时的平均年龄为27个月。
铁死亡转录程序的失调揭示了肝母细胞瘤肿瘤中的关键氧化应激反应改变
对转录组GSE131329（1384个差异表达基因，补充表1）和GSE104766（1933个差异表达基因，补充表2）的第一个和第二个队列进行了监督LIMMA（线性模型用于微阵列和RNA-seq数据）分析。limma分析后，“ferroviz” R库发现第一个队列中有89个独特的铁死亡相关分子失调（补充表1，图1A）。基于这89个分子的未监督主成分分析显示...
讨论
本研究旨在阐明肝母细胞瘤肿瘤中铁死亡失调的分子机制。两个独立队列的转录组分析揭示了一个包含51个基因的铁死亡失调程序，主要与细胞对氧化应激的反应有关，尤其是在肿瘤和神经细胞中。值得注意的是，在肝母细胞瘤肿瘤的神经细胞中观察到了铁死亡驱动基因群的表达...
结论
这项研究是一种基于计算的多组学方法，没有进行功能验证，但它突出了铁死亡转录程序与人类肝母细胞瘤肿瘤中神经细胞可塑性之间的原始联系。揭示了肝母细胞瘤肿瘤中铁死亡失调的复杂分子景观，其特征是参与氧化应激反应、线粒体调节和神经发生的關鍵分子的上调。值得注意的是，...
CRediT作者贡献声明
Jorge Mata-Garrido：写作 - 审稿和编辑，撰写原始草稿，监督，资源管理，项目管理，方法学，研究，资金获取，概念化。í?igo Casafont：可视化，验证，方法学，研究。Christophe Desterke：撰写原始草稿，软件，方法学，研究，正式分析，数据管理，概念化。Raquel Francés：可视化，验证，研究，正式分析。
利益冲突声明
作者声明，关于本手稿的发表没有利益冲突。没有收到任何可能影响本文研究的资金、资助或其他财务支持。此外，作者与任何可能影响计算生物学和化学提交内容的组织或实体没有关联、财务参与或个人关系。
致谢
感谢Hooks等人提供转录组数据集GSE104766，感谢Hiyama等人提供转录组数据集GSE131329，以及感谢Bondoc A等人提供单细胞RNA测序数据集GSE180665。感谢辛辛那提儿童医院医学中心的Peng Vijaykumar Wu等人提供的肝母细胞瘤肿瘤oid的sc-RNAseq数据（GSE233923）。
