《Environment International》：An environmentally relevant phthalate mixture impairs ovulatory prostaglandin and progesterone receptor pathways in human granulosa cells
in vitro
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为探究广泛存在且可能导致女性排卵障碍的内分泌干扰物——邻苯二甲酸盐的作用机制，研究人员以女性尿液中代谢物成分为参考，配制了环境相关水平的邻苯二甲酸酯混合物(MPTmix)，利用体外受精患者来源的原代人卵巢颗粒细胞模型，系统研究了MPTmix暴露对排卵关键介质——孕酮(P4)、孕酮受体(PGR)和前列腺素(PGs)相关通路的影响。结果揭示，MPTmix通过干扰上游LH/hCG受体信号(cAMP/PKA, ERK1/2)、P4合成及PGR表达，进而破坏PGE2和PGF2α的合成、代谢、转运及受体信号，最高可降低77%的活性排卵PG水平，从而损害排卵过程。这项研究首次在人类模型中明确了邻苯二甲酸盐混合物通过破坏P4/PGR-PG轴损害排卵功能的分子机制，为理解环境污染物如何导致女性排卵障碍性不孕提供了关键见解。
在现代社会，女性不孕已成为一个日益严重的健康问题，而排卵障碍是导致其发生的最主要原因。与此同时，人类不可避免地暴露于各种环境化学物质之中，其中邻苯二甲酸盐作为一类广泛使用的增塑剂，存在于从食品包装、建筑材料到化妆品、个人护理品等众多产品中。它们被公认为内分泌干扰物，与不良生殖结局相关联。成年女性由于个人护理品和化妆品的使用，面临着尤其高的暴露风险。尽管流行病学研究已提示邻苯二甲酸盐暴露与女性生育力下降有关，但其直接干扰人类排卵过程的分子机制仍不清楚，这限制了我们全面评估和应对环境因素对不孕症及整体生殖健康的贡献。为了填补这一知识空白，来自美国肯塔基大学医学院的研究团队进行了一项开创性的研究，他们使用从接受体外受精(IVF)的女性体内获取的原代卵巢颗粒细胞，探究了一种模拟人体真实暴露情况的邻苯二甲酸酯代谢物混合物(MPTmix)是如何破坏排卵所必需的关键信号通路的。这项研究结果发表于环境科学领域的高影响力期刊《Environment International》。
为了开展这项研究，研究人员首先根据孕妇尿液中的代谢物水平配制了由6种邻苯二甲酸单酯（包括MEP, MEHP, MBP等）组成的MPTmix，浓度设定为1-500 μg/ml，以模拟从一般人群到高暴露人群（如职业暴露者）的水平。研究的核心模型是从62名IVF患者处获取的原代人卵巢颗粒细胞。这些细胞在体外经过为期6天的“适应”培养，以恢复对人绒毛膜促性腺激素(hCG，临床上用于模拟促黄体生成素LH的作用)的反应性。适应后的细胞能重现体内排卵期的关键事件，包括孕酮(P4)、孕酮受体(PGR)和前列腺素(PGs)水平的升高，为研究环境毒物对排卵机制的干扰提供了稳健的模型。在预处理48小时后，细胞被暴露于含有或不含hCG（以启动排卵级联反应）和不同浓度MPTmix的培养基中，并在0.5至36小时的不同时间点收集样本。研究人员运用了一系列关键技术来全面评估MPTmix的影响：通过酶联免疫吸附试验(ELISA)检测活性前列腺素(PGE2, PGF2α)及其代谢物、孕酮(P4)以及细胞内信号分子（cAMP, p-AKT, p-ERK1/2）的水平；通过比色法或荧光法检测关键酶（PTGS2, HPGD）和蛋白激酶A(PKA)的活性；通过实时定量聚合酶链式反应(qPCR)分析了涉及PG合成、代谢、转运、受体以及P4合成和PGR信号通路的超过20个基因的mRNA表达变化。所有数据均以相对于每位患者自身hCG对照组的百分比变化表示，以考虑个体间差异，并进行了严格的统计学分析。
3.1. MPTmix对前列腺素产生的影响
研究人员发现，MPTmix暴露显著降低了hCG刺激后产生的活性PGE2和PGF2α水平。这种降低伴随着前列腺素合成的关键限速酶——前列腺素内过氧化物合酶2(PTGS2，又称COX2)的蛋白活性和基因表达的下降。同时，负责将前列腺素H2(PGH2)转化为PGE2的主要合成酶PTGES的表达也受到抑制。这些结果清晰地表明，MPTmix通过抑制关键合成酶，损害了排卵期前列腺素的生物合成。
3.2. MPTmix对前列腺素代谢的影响
除了合成减少，MPTmix还改变了前列腺素的代谢平衡。正常情况下，hCG会下调代谢酶15-羟基前列腺素脱氢酶(HPGD)的活性，以维持高水平的活性前列腺素。然而，MPTmix暴露逆转了这一趋势，增加了HPGD的活性和基因表达，促进了前列腺素的失活。更值得注意的是，MPTmix上调了醛酮还原酶家族成员AKR1C1和AKR1C3的表达。AKR1C1能将PGE2转化为PGF2α，而AKR1C3能直接将PGH2转化为PGF2α。这种代谢模式的转变，意味着宝贵的、对排卵至关重要的PGE2被更多地转化或“分流”为作用尚不明确的PGF2α，并通过增强的HPGD活性被加速清除，进一步加剧了活性PGE2的匮乏。
3.3. MPTmix对前列腺素转运体的影响
前列腺素需要在细胞内、外发挥作用，其转运受到精密调控。MPTmix暴露改变了两种关键转运体的表达：它下调了负责将前列腺素泵出细胞的外排转运体ABCC4的表达，同时上调了主要负责摄取前列腺素的转运体SLCO2A1的表达。这种变化可能是一种细胞在面对前列腺素合成不足时的代偿机制，试图通过减少外排和增加摄取来维持细胞内的前列腺素信号水平，但这无法从根本上弥补合成缺陷带来的损失。
3.4. MPTmix对前列腺素受体的影响
前列腺素通过其特异性受体发挥作用，不同受体在卵泡的不同空间位置协调调控排卵事件。MPTmix打乱了这种精密的受体表达谱。它增加了通常在整个卵泡壁表达、起稳定作用的PGE2受体1(PTGER1)的表达，同时减少了主要在卵泡顶端表达、促进破裂的受体PTGER2和PTGER4的表达。这种改变可能导致卵泡壁过度稳定而顶端破裂能力不足，在机制上与未破裂卵泡黄素化综合征(LUFS)的表型相似。
3.5. MPTmix对孕酮合成和孕酮受体的影响
在人类中，排卵期孕酮(P4)及其受体(PGR)的升高是上游事件，直接驱动了下游前列腺素合成酶和转运体的转录。研究发现，MPTmix（尤其是高剂量）降低了hCG刺激后的P4水平，并一致性地抑制了PGR的基因表达。与P4合成相关的关键基因，如类固醇合成急性调节蛋白(STAR)、细胞色素P450家族11亚家族A成员1(CYP11A1)和羟基-δ-5-类固醇脱氢酶(HSD3B2)的表达也受到不同程度的抑制。这表明，MPTmix对前列腺素通路的破坏，很可能源于其对更上游的P4/PGR信号轴的损害。
3.6. MPTmix对LH/hCG激活的细胞内信号级联的影响
LH/hCG与其受体(LHCGR)结合后，会迅速激活包括环磷酸腺苷(cAMP)/蛋白激酶A(PKA)和细胞外信号调节激酶1/2(ERK1/2)在内的多条信号通路。这些通路共同调控PGR表达和PTGS2等基因的转录。研究发现，高剂量(500 μg/ml)的MPTmix在hCG刺激后迅速降低了细胞内cAMP水平、PKA活性以及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)的水平。这表明，在高暴露水平下，MPTmix可能直接干扰了LHCGR的初始信号转导，从而引发下游一系列连锁反应。
研究结论与意义
这项研究首次提供了直接证据，表明暴露于一种基于女性尿液浓度配制的、环境相关水平的邻苯二甲酸酯代谢物混合物(MPTmix)，会通过多种协同机制破坏人卵巢颗粒细胞的排卵期前列腺素功能。MPTmix不仅减少了活性PGE2和PGF2α的产生，还通过改变其合成、代谢、转运和受体可用性来损害其功能。研究提出，这些效应是通过上游抑制P4产生和PGR信号传导介导的，而高剂量的MPTmix还会破坏LH/hCG受体结合后迅速激活的细胞内信号级联。
该研究的核心意义在于，它建立了一个生理学上更相关的研究范式，首次在人类卵巢细胞模型中，使用生物活性的代谢物混合物，揭示了邻苯二甲酸盐破坏排卵关键信号网络的多层面机制。它明确了从初始LHCGR信号，到P4/PGR轴，再到PG合成、代谢、转运和受体信号的完整通路是如何被环境污染物干扰的。这些发现极大地推进了我们对邻苯二甲酸盐如何导致女性排卵功能障碍的机制理解，将流行病学的关联性证据与细胞分子水平的致病机理联系了起来。研究提示，日常生活中不可避免的邻苯二甲酸盐暴露，可能通过干扰这些精细调控的排卵通路，成为女性不明原因排卵障碍及不孕的一个潜在环境因素。这为生殖毒理学的风险评估提供了新的科学依据，并强调了减少相关环境暴露、保护女性生殖健康的重要性。
