《Environmental Research》：Effect-Based Methods and Effect-Based Trigger values for Estrogenicity Monitoring in Surface Water: an Interlaboratory Study
莉维亚·戈麦斯（Livia GOMEZ）|迪米塔尔·马里诺夫（Dimitar MARINOV）|埃莱娜·波塞尔-罗德里格斯（Elena PORCEL-RODRIGUEZ）|迪莱塔·斯卡卡巴罗齐（Diletta SCACCABAROZZI）|伊莎贝拉·桑塞韦里诺（Isabella SANSEVERINO）|皮耶特罗·斯丘托（Pietro SCIUTO）|弗兰克·纳伦杰贾（Frank NARENDJA）|罗曼娜·霍内克-高斯特勒（Romana HORNEK-GAUSTERER）|卡塔琳娜·伦茨（Katharina LENZ）|卡罗尔·查隆（Carole CHALON）|伊夫·马尔内费（Yves MARNEFFE）|普热米斯尔·索尔达恩（P?emysl SOLDáN）|马丁·霍拉（Martin HORA）|马蒂·T·莱帕宁（Matti t. LEPP?NEN）|约翰娜·雅尔维斯托（Johanna J?RVIST?）|尤尔基·维达诺亚（Jyrki VIIDANOJA）|塞利姆·艾特-艾萨（Selim AIT-AISSA）|埃马纽埃尔·梅洛-马雷沙尔（Emmanuelle MAILLOT-MARECHAL）|阿卜杜勒·埃尔·拉赫曼·埃尔·迈斯（Abd El Rahman EL MAIS）|贝亚特·I·埃舍尔（Beate I. ESCHER）|特蕾莎·莱蒂埃里（Teresa LETTIERI）
Piksel s.r.l.，意大利
摘要
基于效应的方法（Effect-Based Methods, EBMs）可以纳入欧洲水框架指令（European Water Framework Directive, WFD），用于评估雌激素类物质。欧盟委员会的联合研究中心（Joint Research Centre）进行了一项实验室间研究，以评估雌激素类EBMs以及基于效应的触发值（Effect-Based Trigger Values, EBTs），研究采用了三种方法：（1）将EBT值与环境质量标准（Environmental Quality Standards, EQS）联系起来；（2）关联体外（in vitro）和体内（in vivo）数据；（3）对特定生物测定的EBT值进行平均处理。来自意大利北部八个地点的地表水样本中含有雌激素激素和内分泌干扰物（Endocrine Disrupting Chemicals, EDCs），十四个实验室使用EBMs对这些样本进行了分析，另有四个实验室进行了化学分析。化学分析结果显示多个样本存在累积风险，其中雌酮（estrone）和双酚A（bisphenol A）是主要风险因素。所有EBMs均检测到了雌激素活性，但特异性存在差异：某些生物测定主要对激素有反应，而其他方法也对非激素类EDCs有反应。在某些样本中，即使没有超过环境质量标准的单一指标，EBMs也检测到了雌激素风险。应用方法1（EBT选项1）与化学分析结果的一致性最高，有八项生物测定完全符合标准，且该方法被证明最具保护性。方法2（EBT选项2）将风险商（Risk Quotient, RQ）降低了30%以上，有两名生物测定完全符合标准；方法3（EBT选项3）使大多数EBMs的风险商变化幅度小于20%，有七项生物测定完全符合化学分析结果。
该研究强调了需要协调EBMs（包括数据评估方法），以应对化学混合物带来的风险，并为成员国在WFD中的应用提供了建议。将EBMs与常规监测相结合，可以增强对激素和EDCs引起的累积雌激素风险的防护。
引言
成千上万的化学物质通过各种途径进入水生环境，包括工业排放、农业径流、污水处理厂和城市雨水（Singh等人，2024年）。这些物质可能相互作用，从而产生比单一化学物质更大的环境危害，对环境和人类健康构成严重威胁（Luijten等人，2023年；Savitz等人，2023年）。其中，激素和内分泌干扰物（EDCs）尤其令人担忧。EDCs会干扰人类和动物的激素系统，而雌激素类激素（Estrogenic Hormones, EHs）由于在极低浓度（pg/L或ng/L）下仍具有活性而尤为重要（K?nemann等人，2018年）。EHs主要通过人类排泄、医疗治疗、避孕措施以及与畜牧业相关的农业活动释放到地表水中（Adeel等人，2017年；Ci?lak等人，2023年），可能对鱼类等敏感水生物种造成不良影响（Jaro?ová等人，2014a,b年）。
欧盟（EU）通过2000/60/EC指令（《水框架指令》，WFD - EC，2000年；EC，2008年；EU，2013年）制定了水质保护策略，为欧盟范围内重点关注的少数物质（Priority Substances, PSs）设定了安全限浓度（即环境质量标准，EQS），以保护人类健康和环境。目前欧盟用于水质监测和评估化学物质合规性的方法是，将目标化学分析检测到的浓度与欧盟层面设定的EQS（EQS Directive，EQSD - EC 2008年）以及成员国为特定河流流域设定的污染物标准（RBSP）进行比较。然而，这种方法无法有效应对复杂化学混合物及其潜在的叠加和协同效应带来的环境风险。为支持新重点物质的识别，WFD于2013年首次引入了“观察名单”机制（EU，2013年）。雌激素类激素（EHs）、雌酮（E1）、17β-雌二醇（E2）和17α-乙烯基雌二醇（EE2）被列入2015年首次发布的观察名单（EU，2015年），并于2018年更新（EU，2018年），持续进行四年监测。根据监测数据的风险评估（例如Loos等人，2018年），上述物质被纳入WFD修正提案中的重点物质清单（EC，2022年）。尽管这些物质是地表水中雌激素活性的主要驱动因素，但其他EDCs也可能对水生环境中的整体雌激素活性产生影响（Gonsioroski等人，2020年；Kunz等人，2017年）。根据欧盟化学品管理局（ECHA）的分类，五种物质被认定为内分泌干扰物并具有潜在雌激素效应，也被纳入WFD的重点物质清单，包括邻苯二甲酸二（2-乙基己基）酯（DEHP）、敌草隆（diuron）、4-壬基酚（4-NP）、4-叔丁基酚（4-tert-octylphenol）和特丁隆（terbutryn）；此外，双酚A（BPA）和三氯生（triclosan）也被纳入WFD修正提案中。然而，WFD或WFD修正提案中未包含的其他雌激素类EDCs（如他莫昔芬（tamoxifen）也可能存在于水生环境中。
这凸显了需要采用能够考虑化学混合物整体影响的监测方法，并据此建立阈值来评估其风险（Wernersson等人，2015年；Altenburger等人，2019年；Drakvik等人，2020年）。基于体外效应的方法（EBMs）提供了一种快速、灵敏且成本效益高的方式，用于筛查具有相同作用机制的化合物。因此，这些方法被提议纳入WFD修正案，并最近获得了理事会的批准（EC，2022年），用于评估地表水中的累积雌激素效应。但在政策实施前，必须对EBMs进行验证和协调。经济合作与发展组织（OECD）的测试指南（例如OECD TG455）中包含了几种体外生物测定方法，用于评估化学物质的（抗）雌激素活性。国际标准化组织（ISO）也制定了ISO 19040系列标准，用于测定水的雌激素潜力（如ISO-Standard 2018-1、2018-2和2018-3）。然而，体外EBM的结果并不能自动表明水的毒性或化学质量不可接受。因此，建立与EBMs相关的阈值至关重要。基于效应的触发值（EBTs）有助于区分可接受和不可接受的EBM反应（Escher等人，2021年；Neale等人，2023a）。根据作用机制（MoAs）定制的EBTs可作为指导：如果生物分析等效浓度（BEQ）低于EBT，则没有风险；如果BEQ等于或高于EBT，则表明存在潜在风险，需要进一步采取措施。
目前尚无普遍接受的单一方法来推导EBTs。文献中提出了不同的方法（Leusch等人，2014年；Tang等人，2014年；Jaro?ová等人，2014a；Kunz等人，2015年；van der Oost等人，2017年；Besselink等人，2017年；Escher等人，2018年；Brion等人，2019年；Escher等人，2021年；Neale等人，2023a），每种方法都有其优势和局限性（Simon等人，2022b）。这种方法的多样性反映了评估多种污染物综合效应的复杂性，以及根据具体环境和目标制定定制解决方案的必要性。
在此框架下，联合研究中心（JRC）发起并领导了一项联合战略行动计划，通过这项实验室间研究来确定化学混合物的环境风险，重点关注雌激素类EBMs。为了确定EBTs，选择了两种文献中的方法：第一种方法（选项1）根据Escher等人（2018年）将触发值与环境质量标准联系起来；第二种方法（选项2）依赖于Brion等人（2019年）确定的体外和体内方法之间的相关性，以证明所使用体外方法的生态相关性及设定的阈值。此外，第三种方法（选项3）是选项1中十一种特定生物测定EBT值的平均值。
这项实验室间研究的目的是为提出雌激素类EBMs的EBTs提供依据，并将不同EBMs的结果与化学分析结果进行比较。为此，收集了八个环境水样（WS），并准备了含有雌激素类激素（EHs，E1、E2和EE2）或雌激素类EDCs（BPA、DEHP、敌草隆、4-NP、4-叔丁基酚、他莫昔芬、特丁隆和三氯生）的混合对照样本。参与实验室使用EBMs（14个参与机构，12种不同的生物测定方法）和/或化学分析（4个参与机构）对这些样本进行了分析和测量。
这些分析的结果通过风险商（RQ）进行了比较，以确定：（i）EBMs是否能够在化学分析相同水平上检测到雌激素类物质；（ii）所测试EBMs的灵敏度是否与化学分析结果一致；（iii）当不存在雌激素类激素时，EBMs是否能够检测到其他EDCs的雌激素效应；（iv）为成员国提供基于证据的讨论和建议，以支持在WFD框架下对雌激素类激素和EDCs的监测。
部分内容摘录
参与实验室
来自11个国家的18个实验室自愿参与了这项实验室间研究，包括欧盟成员国（奥地利、比利时、捷克共和国、芬兰、法国、德国、意大利、西班牙、瑞典）和美国（USA）。其中14个实验室使用十二种不同的EBMs进行了雌激素类活性分析，另外4个实验室进行了化学分析（补充信息，SI，表S1）。
水样和对照
水样来自八个不同的地点
雌激素类激素（EHs）的化学分析
实验室#15、#17和#18获得的结果见补充信息（SI，第2章）。参与实验室#15报告的EM对照物的浓度低于添加样本的浓度。该实验室在多个SPs（2、4、5、6和8）中检测到了雌激素类激素，而参与实验室#17仅在SP3和SP4中检测到了雌激素类激素，但回收率较低。对于EM对照物，该实验室报告未检测到任何雌激素类激素（检测限低于0.02）
讨论
本研究证实，基于效应的监测方法在评估雌激素类激素和雌激素类EDCs的水质方面具有显著优势，这与先前的研究结果一致（Carvalho等人，2014年；Gomez等人，2021年；Simon等人，2022a；Glineur等人，2024年）。EBMs能够在单次测量中捕捉到更多化学物质对生物效应的贡献，超出了化学分析的能力范围。结果还表明，雌激素类激素和EDCs确实具有雌激素活性
结论
本研究为在法律框架内应用EBMs和EBTs提供了科学依据，有助于为成员国制定指导方针，以便在WFD框架下正确实施这些方法。其中，雌激素类EBMs现已准备好投入使用，有些方法已被确认适用于相关目的。它们可以在化学分析之前作为初步筛查工具，用于识别雌激素类激素的存在
作者贡献声明
亨纳·霍勒特（Henner HOLLERT）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。玛丽亚·科尼格（Maria K?NIG）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。塞巴斯蒂安·布欣格（Sebastian BUCHINGER）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。西蒙娜·沃伦韦伯（Simone WOLLENWEBER）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。莫妮卡·波塔利沃（Monica Potalivo）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。马丁·霍拉（Martin HORA）：撰写、审稿与编辑、调查、数据分析。鲁本·吉尔-索尔索纳（Ruben GIL-SOLSONA）：撰写、审稿与
未引用参考文献
ISO标准，2018年；ISO标准，2018年；ISO标准，2018年；Kase等人，2018年；Loos等人，2010年；Neale等人，2017年；Savitz和Hattersley，2023年；Tang和Escher，2014年。
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究由欧盟委员会（EU）联合研究中心（JRC）的“机构研究”计划资助。作者感谢伦巴第大区区域环境保护局（ARPA-Lombardy）的Valeria Marchesi和Laura Tremolada在确定合适的采样地点方面提供的帮助。作者感谢Roberta Carafa在采样活动中的支持，同时感谢Simona Tavazzi、Giulio Mariani和Bernd Gawlik的支持。
