基于刺激响应性DNA水凝胶和聚腺苷酸–金纳米颗粒（polyadenine–AuNPs）的双模式生物传感系统，用于灵敏且快速地检测大肠杆菌O157:H7

《Food Chemistry》：Dual-mode biosensing system based on stimuli-responsive DNA hydrogel and polyadenine–AuNPs for sensitive and rapid detection of Escherichia coli O157:H7

双模式生物传感器基于DNA水凝胶和聚腺苷-金纳米颗粒实现E. coli O157:H7的高灵敏检测，具有色度/荧光双信号输出，检测限低至1 CFU/mL，在复杂食品基质中表现稳定可靠。

　　

王慧媛|杨世琪|栾东雷|边晓军|赖克强|闫娟

国际食品与健康研究中心，农业部上海水产品储存与保鲜质量安全风险评估实验室，上海海洋大学食品科学与技术学院上海工程研究中心，中国上海201306

摘要

大肠杆菌 O157:H7（E. coli O157:H7）由于其低感染剂量和高致病性而构成公共卫生风险，这凸显了快速、灵敏检测方法的必要性。我们报道了一种基于刺激响应型DNA水凝胶和聚腺苷（polyA）-金纳米颗粒（AuNPs）的双模式比色/荧光生物传感器，用于检测E. coli O157:H7。该传感器以含有FAM标记的polyA₁₀扩展适配体的聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶为基质。目标分子的识别会引发适配体的释放和水凝胶的解体，通过polyA₁₀链促进AuNP的分散，并通过适配体增强荧光。该传感器在1×10³至1×10⁹ CFU/mL的浓度范围内显示出线性比色和荧光响应，检测限分别为97 CFU/mL（比色法）和1 CFU/mL（荧光法）。在牛奶、羊肉和鱼样品中的检测回收率为95.6%至108.3%，相对标准偏差（RSD）低于2.3%，证明了其高准确性和重复性。本研究介绍了一种结合“同源激活和异质输出”的双模式检测方法，实现了快速筛查和定量分析，为食品中的病原体监测提供了一种方法。

引言

食源性致病微生物仍然是全球关注的重大问题，对公共卫生和食品系统的完整性构成持续威胁。在这些病原体中，大肠杆菌 O157:H7被认为是最危险的之一，因为它具有极低的感染剂量（仅需大约十个细胞），并且能够引发严重的临床后果，包括出血性结肠炎和溶血性尿毒综合征（Jangid等人，2025年；S. Wang等人，2024年）。流行病学数据显示，大肠杆菌 O157:H7每年导致数十万例感染，造成数亿美元的经济损失，并导致显著的全球死亡率。因此，开发一种快速、灵敏、特异且可在现场使用的大肠杆菌 O157:H7检测技术对于降低公共卫生风险和确保食品安全具有重要的实际意义。

目前，大肠杆菌 O157:H7的检测主要依赖于传统的分析技术。常见的方法包括菌落计数、聚合酶链反应（PCR）和酶联免疫吸附测定（ELISA）。尽管这些方法已经成熟且准确度较高，但它们各有缺点。菌落计数耗时且劳动强度大（Kim & Oh，2020年），而PCR和ELISA虽然灵敏度高，但需要昂贵的仪器和受过培训的人员，不适合食品安全监测中所需的快速、低成本和便携式的现场检测（X. Wang等人，2023年）。生物传感器技术作为一种有前景的替代方案应运而生。生物传感器将生物识别元件（如抗体、适配体或酶）与信号转导组件结合在一起，实现了目标生物分子的特异性和实时检测（Rani等人，2021年）。各种生物传感器，包括光学、电化学和比色格式，已被用于大肠杆菌 O157:H7的快速检测（Zhang等人，2020年）。尽管取得了这些进展，大多数现有生物传感器仅产生一种类型的信号。单一信号输出容易受到环境因素、样品复杂性或操作变化的影响（Sarkar等人，2025年）。这种干扰常常会降低测量的灵敏度和重复性。

近年来，多信号耦合策略（多模式输出）已成为解决这些问题的有希望的方法。特别是双模式生物传感器提供了两种互补的信号——如比色/荧光或电化学/光学——从而提高了灵敏度并增强了数据的可靠性（Sun等人，2023年；Zhou等人，2021年）。它们的内在交叉验证也有助于减少假阳性和假阴性结果。一个典型的例子是Liu等人开发的双模式传感器（Liu等人，2022年），该传感器利用大肠杆菌介导的L-色氨酸降解产生的荧光和比色变化进行现场检测。然而，现有的双模式传感平台仍面临挑战，包括选择性有限、重复性差以及在复杂食品基质中的性能不稳定。因此，开发一种具有高选择性、强稳定性和良好现场适用性的双模式检测系统仍然是一个重要的目标。

脱氧核糖核酸（DNA）水凝胶在智能生物材料中受到了广泛关注，因为它们将水凝胶的三维结构与DNA的生物功能特性结合在一起（Iqbal等人，2021年；Wang等人，2017年）。这些水凝胶不仅具有优异的机械强度和高水分含量，还具有DNA分子固有的可编程性、生物相容性和刺激响应特性（Hu等人，2022年；H. Wang等人，2023年）。当适配体作为交联单元加入时，DNA水凝胶可以实现目标识别、响应和信号转导的集成功能。这使得构建刺激响应型传感平台成为可能（Kahn等人，2017年；Lin等人，2023年）。这类系统在药物递送、疾病诊断和食品安全监测方面显示出巨大潜力（Mo等人，2021年；Chen等人，2025年；X. Wang等人，2025年）。然而，许多当前的设计依赖于信号分子的封装和随后的释放——这一过程通常会增加制备的复杂性和成本，同时可能影响信号的可重复性。

比色传感因其简单性、可视性和低成本而成为现场检测最有前景的输出方式之一（J. Wang等人，2024年）。金纳米颗粒（AuNPs）作为比色传感的核心材料，具有高的消光系数和尺寸依赖的表面等离子体共振特性（Liu & Dong，2023年）。传统的用巯基化DNA修饰AuNPs的方法劳动强度大且成本高，而聚A序列由于其强烈的亲和力，成为更简单和更稳定的替代方案（Zhang等人，2019年；Chen等人，2024年）。在polyA–AuNP系统中，polyA能有效防止在高盐条件下AuNPs的非特异性聚集。因此，目标的存在与否会引起明显且可区分的颜色变化（Tu等人，2023年）。这种机制提供了一种简单可靠的比色信号生成策略。

基于这些进展，我们开发了一种基于聚丙烯酰胺/DNA的双模式生物传感系统，用于快速、灵敏和现场检测大肠杆菌 O157:H7。在该系统中，针对大肠杆菌 O157:H7的适配体与聚丙烯酰胺/DNA网络中的互补DNA序列相互作用，形成三维杂化水凝胶。在目标病原体（大肠杆菌 O157:H7）存在的情况下，适配体-细菌结合会破坏水凝胶网络并释放出经过polyA修饰的适配体。释放的适配体通过其polyA尾部与AuNPs结合，防止盐诱导的聚集并产生明显的比色响应。同时，适配体上的FAM荧光团提供荧光信号，实现双模式定量检测。与传统的基于培养和PCR的检测方法以及新兴的基于DNA的平台（如DNA-Foil技术，用于快速病原体检测（El Sheikha，2021年）相比，当前策略将目标识别、结构转化和信号输出集成在单一的刺激响应型水凝胶基质中。这种设计消除了复杂的探针固定程序或复杂分析仪器的需求，从而提高了操作的简便性和现场适用性。该系统提供了三级检测方案——肉眼观察、荧光测量和UV–vis吸光度——允许对大肠杆菌 O157进行定性、半定量和定量识别。重要的是，双模式输出使得比色响应适用于快速现场筛查和实时过程监测，而荧光信号则提供了更高的灵敏度和定量准确性，可以作为食品安全保障的独立或最终分析方法。无需依赖复杂的仪器或额外的信号放大步骤，所提出的策略实现了高灵敏度、强选择性和低成本，以及出色的现场适用性。因此，它为食品安全监测中大肠杆菌 O157的快速检测提供了一种创新和实用的解决方案。

材料

本研究中使用的所有DNA寡核苷酸均由Sangon Biotech有限公司（中国上海）合成和纯化。详细序列见表S1。过硫酸铵（APS）、N,N,N′,N′-四甲基乙二胺（TEMED）、丙烯酰胺、1× Tris-EDTA（TE）缓冲液（10 mM Tris-HCl，1 mM EDTA，pH 7.8–8.2）、1× TBE缓冲液、4S Red Plus核酸染料（10,000×水溶液）和DNA标记物均从Sangon Biotech（中国上海）购买。

基于聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶的比色/荧光双模式生物传感器的构建和机制

图1清楚地展示了本研究中开发的用于检测大肠杆菌 O157:H7的刺激响应型DNA水凝胶双模式生物传感器的工作原理。该策略的核心在于特定生物识别、水凝胶智能响应和多通道信号输出的集成。首先，我们通过自由基聚合构建了传感器的骨架网络。具体来说，两端修饰有丙烯酸的短链DNA（SA和SB）与...

结论

在本研究中，我们开发了一种基于聚丙烯酰胺/DNA杂化水凝胶的刺激响应型生物传感器，用于快速且高度灵敏的双模式检测大肠杆菌 O157:H7。该系统使用多功能DNA适配体作为动态交联单元。该适配体一端带有FAM荧光团，另一端带有polyA??片段。通过碱基配对，适配体在单一分子结构中实现了识别、交联和信号输出。

未引用的参考文献

Bai等人，2022

Bian等人，2023

Cui等人，2025

Hu等人，2024

Hu, Gao, Lu和Ying，2022

Lin等人，2025

Liu等人，2024

Wang等人，2024

Yang, Luo, Tian, Qian和Duan，2020

Zhang等人，2019

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了国家自然科学基金（编号：21775102、32272391）和上海市自然科学基金（编号：20ZR1424100）的资助。