共价交联的核桃蛋白-原花青素复合纳米颗粒：制备、表征及Pickering乳化性能

《Food Chemistry》：Covalently cross-linked walnut protein-proanthocyanidin composite nanoparticles: Preparation, characterization, and Pickering emulsifying properties

核桃蛋白与多酚共价交联制备纳米颗粒，优化浓度为0.1%时粒径127.3 nm，表面电荷-10.36 mV，显著提升乳液稳定性、抗氧化性及消化缓释效果，储存5天无分层。

　　

作者：Dina Chang、Lixia Ma、Yan Yan、Anxu Zheng、Xuehang Wang、Yue Leng、Bin Jiang、Dayong Ren、Lixin You、Ji Wang

吉林农业大学食品科学与工程学院，长春 130118，中国

摘要

本研究在碱性有氧条件下通过共价交联方法制备了核桃蛋白（WP）-原花青素（PC）复合纳米颗粒，并评估了其作为皮克林乳液稳定剂的性能。系统地表征了WP-PC纳米颗粒的物理化学性质以及相应乳液的功能性、流变学特性、体外消化行为和储存稳定性。WP-PC（0.1%）表现出最佳性能：粒径小（127.3 nm）、表面电荷高（-10.36 mV）、溶解度提高、形态均匀呈球形，并具有优异的热稳定性和抗氧化活性。由WP-PC（0.1%）稳定的皮克林乳液具有小液滴尺寸（332.26 nm）、低界面张力（13.05 mN/m）、良好的发泡性能、典型的剪切稀化流变学特性以及良好的消化稳定性（游离脂肪酸释放率为18.9%，PC生物利用率为47.33%），且在储存5天内没有出现相分层现象。总体而言，WP与0.1% PC的共价结合制备出了高性能纳米颗粒，这些纳米颗粒稳定的乳液在功能性食品中作为营养输送载体具有应用潜力。

引言

皮克林乳液是一类由固体颗粒而非传统小分子表面活性剂稳定的乳液系统。与表面活性剂稳定的传统乳液相比，皮克林乳液不仅具有更好的物理稳定性（例如，储存稳定性和抗聚结性），还具有低毒性、降低生产成本和优异的环境兼容性等显著优势。这些优点使皮克林乳液在食品加工（例如，功能性油脂输送）、化妆品开发（例如，基于乳液的护肤产品）和药物制剂（例如，药物载体）等领域具有广泛的应用前景（Lu等人，2024年）。在皮克林乳液系统中，乳化剂起着关键作用：它们不可逆地吸附在油水界面形成致密的稳定界面膜。该膜不仅有效稳定了乳液的分散相并抑制了液滴聚结/相分层，还调节了功能性活性成分的释放动力学和靶向输送效率，直接决定了乳液的整体性能和实际应用性（Chen等人，2020年）。植物蛋白因其优异的生物相容性、界面活性、平衡的亲水-疏水性质、丰富的可用性和生物降解性，在食品工业中被广泛用作食品级皮克林乳液的理想稳定剂（Ji & Luo，2023年）。

核桃蛋白（WP）是核桃油提取过程中的主要副产品，含有超过60%的蛋白质和人体所需的全部八种必需氨基酸。除了营养价值外，WP还表现出显著的抗氧化和抗炎活性，具有多种健康益处，如调节肠道微生物群（例如，促进有益细菌的增殖和代谢）、改善脂质代谢、增强免疫功能以及促进钙吸收。与大豆蛋白和乳清蛋白相比，WP的过敏原含量极低，更适合敏感人群。此外，WP还具有良好的加工性能，包括高溶解度、乳化性能和持水能力——这些特性可以有效改善食品的质地（例如，增加饮料的稠度和提高肉制品的嫩度），进一步支持其作为食品加工理想蛋白质来源的地位。值得注意的是，WP可以通过自组装技术制备成核桃蛋白纳米颗粒（WPNPs）。这些WPNPs保留了WP的生物相容性和生物粘附性，同时获得了纳米级特有的优势，使其成为理想的功能性载体。例如，经过pH调节后，自组装的WPNPs的溶解度显著提高（Lv等人，2023年），并且当用作包封载体时可以有效提高姜黄素的稳定性。在另一项研究中，通过膜分离纯化的WP经过超声处理后，其分子构象变得更加灵活和展开（Zhou等人，2025年）；随后将系统pH调整至7.0后，WP重新折叠自组装成小尺寸的聚集体，为WPNPs的精确制备提供了可行策略。

原花青素（PC）是一类水溶性植物多酚，由于其独特的分子结构，具有强大的抗氧化、抗炎和抗菌活性，在食品功能化和活性成分输送方面具有显著的应用价值。大量研究表明，通过蛋白质和PC之间的非共价相互作用（例如，氢键、疏水相互作用和静电相互作用）形成的复合纳米颗粒在乳液稳定方面具有独特优势。例如，由鲭鱼蛋白和PC组成的固体颗粒作为高效稳定剂，适用于高内相皮克林乳液，具有平衡的亲水-疏水性质（Zhou等人，2022年）。在一项关于豌豆蛋白-PC乳液制备的研究中，加入PC不仅通过调节豌豆蛋白的界面性质增强了乳化活性，还提高了乳液的长期储存稳定性并抑制了液滴聚集和分层（Dai等人，2020年）。另一项研究报告称，大豆蛋白与多酚共价结合后，蛋白质在复合物中展开，所得结合物相对于天然大豆蛋白表现出显著提高的抗氧化能力和乳化性能（Pi等人，2022年）。具体对于WP，Deng等人（2025年）发现，通过非共价作用（氢键和疏水作用）处理的WP与PC结合后，乳化性能和稳定性得到改善。然而，虽然非共价结合方法易于实施，但它们产生的相互作用相对较弱，在加工过程中容易受到破坏。相比之下，共价结合通常涉及多酚醌与蛋白质的亲核氨基酸残基（例如，赖氨酸和半胱氨酸）之间形成稳定的C-N或C-S共价键，从而在苛刻的加工条件下保持生物分子结合物的结构完整性和功能性质。Wu等人（2025年）使用核桃衍生的多酚与WP形成共价结合物，不仅稳定了油包水（O/W）乳液，还提高了水的分散性、乳化能力和发泡性能以及抗氧化活性，同时提高了β-胡萝卜素的包封效率。综上所述，这些发现突显了蛋白质-PC复合纳米颗粒，特别是通过共价交联形成的纳米颗粒，作为高性能和多功能食品级乳液稳定剂的巨大潜力。

尽管取得了这些进展，但关于通过WP-PC相互作用制备复合纳米颗粒及其作为皮克林乳液稳定剂的后续应用的系统研究仍然较少。这一研究空白限制了WP在食品级功能性乳液中的进一步发展和应用。为了解决这个问题，本研究在碱性有氧条件下通过WP与PC的共价交联（浓度为0.1%、0.2%和0.3%，w/w）制备了WP-PC复合纳米颗粒，并系统研究了其形成机制和物理化学性质。随后，将这些复合纳米颗粒用作稳定剂，通过油包水均质化过程制备了皮克林乳液。全面评估了所得皮克林乳液的功能特性、流变行为、体外消化性能和储存稳定性。这项工作不仅为构建新型植物蛋白-多酚复合纳米材料提供了关键的理论数据和机制见解，也为这类复合材料在皮克林乳液系统中的应用提供了实用的技术参考。

材料

WP是在吉林农业大学发酵工程实验室使用碱溶酸沉淀法制备的。纯度为95%的PC和甘油三辛酸酯（GTCC）购自上海阿拉丁生化科技有限公司（中国上海）。BCA蛋白浓度测定试剂盒购自上海碧云天生物科技有限公司（中国上海）。十二烷基硫酸钠（分析级）由天津丰川公司提供。

WP-PC纳米颗粒的粒径分布和静电性质

如图1A所示，WP-PC纳米颗粒的平均粒径范围为127.30 ± 3.28 nm至232.83 ± 5.22 nm，明显大于WP的粒径（44.00 ± 0.35 nm）（P < 0.05），并且随着PC浓度的增加粒径逐渐增大。这种粒径的增大可归因于碱性反应环境，该环境导致WP分子结构展开和内部疏水氨基酸残基的暴露。

结论

在碱性条件下，PC中的氧化酚羟基与WP侧链上的亲核氨基酸残基形成共价键，改变了WP的分子结构和空间构象。值得注意的是，含有0.1% PC的WP-PC复合纳米颗粒表现出最佳的物理化学性质，包括粒径减小、表面负电荷密度增加、WP溶解度提高以及抗氧化活性增强。

CRediT作者贡献声明

Dina Chang：撰写初稿、方法论设计、概念构思。 Lixia Ma：数据分析、数据整理。 Yan Yan：数据可视化、验证。 Anxu Zheng：项目监督、资源协调。 Xuehang Wang：软件操作、实验研究。 Yue Leng：方法论设计。 Bin Jiang：项目管理。 Dayong Ren：概念构思。 Lixin You：撰写与编辑、项目管理、数据分析。 Ji Wang：撰写与编辑、方法论设计、资金筹集。

利益冲突声明

作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本工作得到了吉林省科学技术发展计划项目（编号：20240101230JC）的支持。