利用微波辅助技术从稻草木质纤维素残渣中提取酚类化合物的绿色优化方法，以及基于液相色谱-高分辨质谱（LC-HRMS）的品种分析技术

《Food Chemistry》：Green optimisation of microwave-assisted extraction of phenolic compounds from rice straw lignocellulosic residues and LC-HRMS-based cultivar profiling

水稻秸秆微波辅助提取工艺优化及多品种酚类指纹分析，采用Box-Behnken设计考察温度、乙醇浓度等参数对提取率（18.9%）、总酚含量（796 mg GAE/100 g DW）及抗氧化活性（FRAP 32.3 μmol TE/g DW）的影响，结合LC-ESI/LTQ-Orbitrap-HRMS/MS实现化合物级解析，发现不同品种及收获年度存在显著酚类组成差异，验证了MAE-质谱联用技术的可持续性与精准评估价值。

　　

劳拉·圣塞巴斯蒂安（Laura San Sebastián）、艾米丽·P·拉维里亚诺-桑托斯（Emily P. Laveriano-Santos）、罗莎·玛丽亚·拉穆埃拉-拉文托斯（Rosa María Lamuela-Raventos）、阿方索·希门尼斯（Alfonso Jimenez）、安娜·瓦尔韦杜-克雷阿尔特（Anna Vallverdú-Queralt）、玛丽亚·卡门·加里戈斯（María Carmen Garrigós）、玛丽娜·拉莫斯（Marina Ramos）

西班牙阿利坎特大学分析化学、营养与食品科学系，阿利坎特，03080

摘要

本研究将稻草作为一种抗氧化酚类化合物的来源进行了利用。采用Box–Behnken设计优化了微波辅助提取（MAE）方法，以评估温度、乙醇浓度、溶剂体积和提取时间对提取产量、总酚含量（TPC）和抗氧化能力的影响。结果表明，温度和时间是关键因素。最佳条件为80°C、60%乙醇、50毫升溶剂、40分钟提取时间，此时提取产量为18.9%，总酚含量为796毫克/100克干物质（GAE/100 g DW），抗氧化活性较高（FRAP值为32.3，ABTS值为43.2 μmol TE/g DW）。通过液相色谱-电喷雾离子化-串联质谱-轨道阱高分辨质谱（LC-ESI/LTQ-Orbitrap-HRMS/MS）技术对酚类化合物进行了详细分析，发现4-羟基苯甲酸和槲皮素-3-葡萄糖苷为主要成分。该优化流程应用于2019-2020年收获的11个稻米品种，发现不同品种和年份的酚类成分及抗氧化性能存在差异。总体而言，MAE-Orbitrap方法能有效提取富含酚类的物质，但还需进一步研究其稳定性、安全性及在食品应用中的法规问题。

引言

水稻（Oryza sativa L.）是一种营养价值高的谷物，是全球主要农作物之一，富含碳水化合物、蛋白质、脂质、纤维和灰分。不同品种之间存在一定差异（Rodríguez, 2007）。在瓦伦西亚地区，水稻种植面积较大，对当地生态系统的可持续性有重要贡献。该地区主要种植的品种包括Bomba、J Sendra、Italia Onice和Sirio，这些品种在粒形、抗病性和灌溉需求方面存在差异。其中，Bomba品种因煮后仍能保持松散状态而受到特别关注（Maroto Luján, 2016）。

水稻种植产生的主要废弃物是稻草（Ribó, Albiach, Pomares, & Canet, 2017）。稻草主要由植物茎叶组成，产量较大，但价值较低，通常含有35%的纤维素、18%的半纤维素、20%的木质素和15%的灰分（Ribó et al., 2017）。传统上，稻草被焚烧，但这种做法会对环境造成负面影响，如温室气体排放和空气污染。最新研究表明，焚烧稻草会释放有害物质，增加呼吸系统疾病风险（Le, Khoi, & Mallick, 2022），且不良气象条件会加剧这一问题（Domínguez-Escribà & Porcar, 2010）。此外，这些排放物还会产生大量污染大气颗粒物和挥发性有机化合物（Phuong et al., 2021），影响空气质量、气候调节和水文循环。因此，西班牙农业、农村发展、气候紧急事务和生态转型部根据欧盟共同农业政策（CAP）要求，实施了相关法规（2016年4月第7号法令），逐步限制露天焚烧，并从2022年收获季节起全面禁止（Conselleria d'Agricultura, 2016）。这促使人们寻求替代处理方式，尤其是针对每年收获后遗留的约10万吨稻草（Capanoglu, Nemli, & Tomas-Barberan, 2022; Torregrosa, Miguel Giner, & Velázquez-Martí, 2021）。

全球向循环经济转型的趋势推动了对可持续和环境友好型农业废弃物处理方法的探索。由于稻草成分复杂且生物降解性差，它成为生产高附加值产品的潜在原料（Gummert, Van Hung, Chivenge, & Douthwaite, 2019; Kaur, Kaur, Kaur, & Kaur, 2024; Martínez-Guillén, álvarez-Martínez, Micol, & Barrajón-Catalán, 2025）。稻草常被用于提取纤维素或木质素，同时也可提供具有食品、化妆品和制药行业应用潜力的酚类化合物（Ramos et al., 2023）。酚类化合物是一类通过次级代谢途径形成的植物代谢产物，其特征是含有至少一个含有羟基的芳香环。在植物中，它们通过参与色素形成和防御病原体攻击等机制发挥多种作用（Apak, ?zyürek, Gü?lü, & ?apano?lu, 2016）。这些化合物在细胞内以可溶形式存在于液泡中或与细胞壁不溶性成分结合（Rajbhar, Dawda, & Mukundan, 2015）。从营养角度来看，膳食中的酚类化合物有助于预防退行性疾病，这主要归因于其抗氧化特性（Apak et al., 2016）。稻草中的酚类化合物主要包括酚酸、芪类和黄酮类（Ramos et al., 2023）。这类化合物结构多样，影响其理化和提取特性。高效提取这些化合物需限制降解（Martinez, 2010）。

固液萃取是释放生物活性化合物的传统方法，关键参数包括溶剂组成、颗粒大小、提取时间、温度、固液比和pH值（Rajbhar et al., 2015）。Karimi等人（2014）使用水-有机溶剂在高温下通过索氏萃取法从稻草和米壳中提取酚类和黄酮类化合物，酸水解处理可提高提取效率，并在酸性条件下增强其溶解性（Rajbhar et al., 2015）。

近年来，基于绿色加工原理的提取方法被开发出来，以更高效地获取天然生物活性物质。这些方法通常能减少溶剂消耗和加工时间，同时保持高产量和良好的重复性（Ramos et al., 2023）。例如亚临界水萃取（SWE）、微波辅助萃取（MAE）和超声辅助萃取（UAE）等绿色提取技术，是传统方法的有效替代方案，符合可持续性要求（Ramos et al., 2023）。研究表明，MAE具有高效的时间和溶剂利用效率，且相比传统方法对环境影响较小（López-Salazar, Camacho-Díaz, Arenas Ocampo, & Jiménez-Aparicio, 2023），其在农业废弃物中的应用效果也得到了广泛验证（Bezerra & Koblitz, 2025; Zhu, Ma, Zhang, Zhang, & Sun, 2025）。不过，本研究未评估定量可持续性指标（如能源消耗和溶剂回收率）。

多项研究表明，这些技术可用于稻米副产品的处理。Wataniyakul等人（2012）发现微波预处理后使用SWE可提高脱脂泰国米糠中总酚的提取效率；Freitas等人（2020）从西班牙瓦伦西亚L'Albufera自然公园的J. Sendra品种稻草废弃物中通过超声预处理和回流加热获得高抗氧化和抗菌活性的提取物；Leonarski等人（2025）利用MAE技术从黑米糠中提取花青素。据我们所知，目前尚无关于使用MAE从Bomba品种稻草或其他地中海品种中提取酚类化合物的研究。此外，大多数研究仅针对单一批次或品种，缺乏经统计验证的优化方法和高分辨率成分分析，限制了提取方案的通用性。

用于分析酚类代谢物的技术中，液相色谱与高分辨率串联质谱（LC-ESI/LTQ-Orbitrap-HRMS）结合电喷雾离子化源和混合高分辨质谱仪是一种强大且多用途的方法（Kodikara, Netticadan, Bandara, Wijekoon, & Sura, 2024; Laveriano-Santos et al., 2022; Vallverdú-Queralt et al., 2017）。该方法具有高质量准确性和分辨率，可在复杂植物基质中准确鉴定化合物。

这些进展结合现代化学计量学方法，加速了基于HRMS的代谢组学应用，例如在食品 authenticity、品种鉴定和质量评估中的应用，其中多变量模型（如PCA/OPLS）用于从复杂数据集中提取可靠指标（García-Pérez, Becchi, Zhang, Rocchetti, & Lucini, 2024）。线性离子阱（LTQ）与轨道阱质谱仪的结合可实现多级碎片化（MS^n），有助于解析异构酚类化合物和检测低丰度代谢物。电喷雾离子化的灵敏度使得该平台成为代谢组学分析、品种鉴定和木质纤维素废弃物或稻米品种抗氧化提取物表征的参考标准（Pinto et al., 2023）。

通过响应面法（RSM）优化的微波辅助萃取（MAE）提高了农业废弃物中抗氧化提取物的回收率（Elzaawely, Maswada, El-Sayed, & Ahmed, 2017; Holic et al., 2018; Islam et al., 2026; Menzel, González-Martínez, Vilaplana, Diretto, & Chiralt, 2020）。然而，在稻草研究中，优化通常针对单一批次或品种，缺乏化合物级别的解析结果。LC-HRMS/MS（如Orbitrap）可提高化合物鉴定的可靠性并支持酚类成分的准确分析（Chen et al., 2025）。目前，Box–Behnken优化的MAE方法尚未与LC-ESI/LTQ-Orbitrap-HRMS/MS结合使用，也未在多个品种和年份中进行评估。本研究创新之处在于在两年内对11个品种应用统一协议，实现了在不同提取条件下的品种间成分差异分析。因此，本研究旨在通过RSM方法优化Bomba品种稻草中的酚类化合物提取，通过LC-ESI/LTQ-Orbitrap-HRMS进行进一步表征，然后应用于2019-2020年L'Albufera自然公园地区收获的11个品种的稻草，包括Bomba、J. Sendra、Sirio、Albufera、Fonsa、Arpa、Onice和一种黑色品种稻草，以评估提取效果的品种间差异。

材料与化学品

本研究收集了2019和2020年收获季节来自西班牙瓦伦西亚L'Albufera自然公园地区的不同稻米品种的稻草。共分析了11个品种的稻草，包括Bomba、J. Sendra、Sirio、Albufera、Fonsa、Arpa、Onice和一种黑色品种稻草。植物材料的详细信息（品种、来源/收获信息和样本编码）见补充材料（表S1）。

Bomba品种稻草（BRS）的特性分析

研究了BRS的化学组成，以评估其作为农业、生物能源和环境管理可再生资源的潜力。BRS的成分包括12.4±0.2%的灰分、7.2±0.4%的水分、3.2±0.5%的蛋白质、7.5±0.9%的脂肪和69.6±0.6%的碳水化合物。这些结果与文献报道一致（Ramos et al., 2023），但不同品种的稻草成分可能存在差异。

结论

本研究通过微波辅助萃取（MAE）优化了从BRS木质纤维素基质（纤维素、半纤维素、木质素）中释放天然酚类抗氧化剂的效率和时间效益。最佳条件为40分钟提取时间、50毫升60%乙醇（体积比）和80°C温度。在此条件下，三次重复实验的提取产量为18.9±0.9%，总酚含量为796.1±77.6毫克/100克干物质（GAE/100 g DW），FRAP抗氧化活性为32.3±1.4 μmol TE/g DW，ABTS抗氧化活性为43.2±1.8 μmol TE/g DW。

作者贡献声明

劳拉·圣塞巴斯蒂安（Laura San Sebastián）：负责撰写初稿和实验研究。艾米丽·P·拉维里亚诺-桑托斯（Emily P. Laveriano-Santos）：负责撰写、审稿和编辑，以及实验研究和数据分析。罗莎·玛丽亚·拉穆埃拉-拉文托斯（Rosa María Lamuela-Raventos）：负责方法设计和概念框架。阿方索·希门尼斯（Alfonso Jimenez）：负责撰写、审稿和编辑，项目管理和资金申请。安娜·瓦尔韦杜-克雷阿尔特（Anna Vallverdú-Queralt）：负责撰写、审稿和编辑，方法设计和数据管理。玛丽亚·卡门·加里戈斯（María Carmen Garrigós）：负责撰写、审稿和编辑，项目管理和资金申请。

致谢与资助

本研究得到了西班牙科学、创新与大学部及创新、大学、科学与数字部（PID2023-1528690B-C21、MFA/2022/061、BEST/2021/014、PID2020-114022RB-I00）、卡洛斯三世健康研究所（ISCIII）（隶属于科学、创新与大学部（AEI/FEDER, EU）以及加泰罗尼亚自治区政府（GC）（[2021-SGR-00334、[2021-SGR-00311]）的资助（INSA-UB为Maria de Maeztu卓越单位，项目编号CEX2021-001234-M）。

利益冲突声明

作者声明没有可能影响本研究的已知财务利益或个人关系。