从油菜籽蛋白水解物中分离并鉴定新型铁结合肽：结构分析及螯合机制

《Food Chemistry》：Isolation and characterization of novel Iron-binding peptides from rapeseed protein hydrolysates: Structural analysis and chelation mechanisms

油菜蛋白通过蛋白酶水解后产生的多肽具有高效铁螯合能力，Protease M水解180分钟时效果最佳，经多步骤纯化得到DWK（Asp-Trp-Lys）和FLDLL（Phe-Leu-Asp-Leu-Leu）两种肽段，其Fe2+结合能力分别达246.56±3.19和244.26±4.78 mg/g。结构分析表明Asp、Lys和Leu残基通过羧基和水介导形成稳定八面体配位结构，静电和配位作用共同驱动螯合能力，并伴随肽链重排和热稳定性增强。

　　

张传阳|王彦志|刘博业

河南省工业大学食品科学与工程学院，郑州450001，中华人民共和国

摘要

采用邻菲罗林法评估了单酶水解所得菜籽蛋白（RP）水解物对Fe²⁺的螯合能力。在六种酶中，Protease M在180分钟时的螯合能力最强。通过超滤、离子交换和凝胶过滤对水解物进行纯化，得到了两种肽：DWK（Asp-Trp-Lys）和FLDLL（Phe-Leu-Asp-Leu-Leu），并通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）对其进行了鉴定。这些肽的Fe²⁺螯合能力分别为246.56±3.19 mg/g和244.26±4.78 mg/g。结构分析（包括扫描电子显微镜、傅里叶变换红外光谱、粒径分析、热重分析和分子建模）表明，Asp、Lys和Leu等残基通过羧基和水介导的配位与Fe²⁺形成稳定的八面体复合物。螯合作用主要由静电和配位相互作用驱动，导致肽链重排并增强结构紧凑性和热稳定性。这些发现阐明了RP衍生肽的螯合机制，并支持DWK和FLDLL作为功能性食品和营养补品的有效植物来源铁补充剂。

引言

铁是人体中必需的微量元素，在氧气运输、能量代谢和免疫调节等关键生理过程中起着重要作用（Duck & Connor, 2016; Enko, 2025）。铁缺乏在易感人群中尤为普遍（Miao et al., 2019），包括婴儿、孕妇和老年人（Shen et al., 2024），可能导致缺铁性贫血（IDA）。在严重情况下，还可能引发败血症和肠梗阻等并发症（Ding, Xu, et al., 2024; Zhang, Jia, et al., 2021）。虽然饮食是铁的主要来源，但食物中的血红素铁含量有限，而非血红素铁的吸收效率也相对较低。此外，植酸和多酚等饮食因素常常抑制其生物利用度。因此，开发具有高安全性、高效性和生物利用度的新型铁补充剂已成为当前营养研究的核心课题（Gao et al., 2019; Wen et al., 2020）。因此，当前的研究重点在于开发安全、有效且吸收率高的新型铁补充剂。

市售的铁补充剂主要包括无机铁盐（如硫酸亚铁和氯化铁）和有机铁复合物（如葡萄糖酸亚铁和聚麦芽糖铁（Athira et al., 2021; Tian et al., 2023; Yan et al., 2025）。尽管这些补充剂可以部分缓解铁缺乏，但它们存在一些缺点：无机铁盐吸收效率低、氧化稳定性差，可能引起胃肠道刺激和不适（Baldi et al., 2024）；某些有机铁复合物在体内可能释放游离铁离子，引发氧化应激，损害组织并影响健康（Liu, Yu, et al., 2022）。因此，开发具有高吸收率和稳定性的功能性铁补充剂具有重要的研究价值和应用前景。

肽-铁螯合物，尤其是由小肽形成的螯合物，因其结构稳定性、胃肠道耐受性和高生物利用度而成为有前景的替代品（An et al., 2025; Cheng et al., 2023; Fan, Wang, et al., 2023）。为了获得这些生物活性配体，目前最有效的策略是酶法水解。最近的研究已成功使用商业蛋白酶（如Alcalase、Flavourzyme）从不同来源（如乳清和绿豆）中筛选出铁螯合肽（Athira et al., 2021; Ding, Li, et al., 2024）。然而，大多数研究仅采用通用筛选方法，亟需基于蛋白酶切割特异性的合理策略来靶向特定结合位点。在植物来源中，菜籽蛋白是一个有潜力但未得到充分利用的候选材料。除了作为丰富且低成本的副产品外，它还具有富含酸性（Asp、Glu）和含硫残基的平衡氨基酸组成，这些残基被认为是金属离子螯合的关键位点（Beaubier et al., 2023; Durand et al., 2021）。因此，使用能够特异性切割这些残基附近的蛋白酶对菜籽蛋白进行水解是一种释放高亲和力肽的有效方法（Wu et al., 2021; Yang et al., 2023）。然而，关于菜籽蛋白衍生肽对亚铁离子螯合的系统性研究仍较少，缺乏对生物活性螯合肽的筛选、结构特征及其配位机制的深入研究。

为此，本研究通过筛选具有不同切割特性的六种蛋白酶，最大化了高Fe²⁺结合能力的肽的释放。随后，通过超滤和离子交换色谱的顺序纯化策略分离出特定的高亲和力组分，并通过LC-MS/MS确定了准确的肽序列。最后，通过固相肽合成（SPPS）技术合成了这些肽。利用傅里叶变换红外光谱（FTIR）、X射线衍射（XRD）、扫描电子显微镜（SEM）和能量色散X射线光谱（EDS）系统表征了它们在Fe²⁺螯合下的结构变化，并结合分子动力学模拟阐明了精确的配位模式和稳定机制。本研究旨在为开发安全、高效的植物来源铁补充剂提供理论支持和技术指导，有助于缓解铁缺乏问题。

材料与化学品

菜籽蛋白购自中国山西恒然生物科技有限公司。Alcalase、Neutrase和胰蛋白酶购自丹麦Bagsvaerd的Novozymes公司。Protease M由日本名古屋的Amano Enzyme公司提供。Flavourzyme和木瓜蛋白酶购自美国密苏里州圣路易斯的Sigma-Aldrich Chemical公司。Sephadex G-25和Q Sepharose FF购自中国北京的SolarBio Science and Technology公司。DL-二硫苏糖醇（DTT）、邻苯二甲醛（OPA）等试剂也用于实验。

蛋白酶特异性对Fe²⁺结合能力的影响

使用不同的蛋白酶（Alcalase、Flavourzyme、胰蛋白酶、Protease M、Neutrase和木瓜蛋白酶）对菜籽蛋白进行水解。如图1A所示，所得肽-亚铁螯合物的Fe²⁺结合能力在不同酶解条件下有所不同。随着酶解的进行，Fe²⁺结合能力先增加后下降。这种趋势归因于具有金属结合潜力的功能性肽的释放。

结论

总之，通过Protease M对菜籽蛋白进行系统水解，并采用多步骤靶向纯化（超滤、离子交换和凝胶过滤）策略，鉴定出两种新型肽DWK和FLDLL，其Fe²⁺螯合能力分别为246.56±3.19 mg/g和244.26±4.78 mg/g。这些肽的强螯合能力归因于酶解诱导的序列暴露效应。

作者贡献声明

张传阳：撰写初稿、实验设计、数据分析。王彦志：方法学设计、实验实施、数据分析。刘博业：文章修订与编辑、资金申请。

利益冲突声明

作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了河南省工业大学“国家自然科学基金培育项目”（项目编号：2024PYJH004）、“国家自然科学基金”（项目编号：31901640）以及“河南工业大学拓新团队培育项目”（项目编号：2024TXTD04）的支持。