基于蛋白质组学和脂质组学的MALDI-TOF质谱技术，用于快速区分食品中的蜡样芽孢杆菌（Bacillus cereus）、苏云金芽孢杆菌（Bacillus thuringiensis）及其产生呕吐物的菌株

《Food Chemistry》：Proteomic-lipidomic based MALDI-TOF MS for rapid discrimination of Bacillus cereus and Bacillus thuringiensis and its emetic-producing strain in food

基于质谱组学与脂谱组学联用策略，本研究通过优化培养基和提取方法构建了包含7株Bacillus菌的专用参考数据库，显著提升商业数据库（置信度2.56-2.84）的物种鉴定准确率。创新性采用"单点双采集"工作流程，直接检测1175、1191和1205 Da毒素特征峰，无需二次提取。质谱联合分析鉴定出6种脂质标志物实现菌种 definitive区分，该三级递进式鉴定体系（菌种区分-产毒鉴定-毒素检测）有效解决了B. cereus与B. thuringiensis的物种鉴定难题，为食品中近缘菌属的快速筛查和公共卫生监测提供新范式。

　　

曾曦|王宇|梅云佩|贾宝珠|王宏|徐振林

中国华南农业大学食品科学学院，广东省食品质量与安全重点实验室，广州510642

摘要

由于《蜡样芽孢杆菌》（Bacillus cereus）和《苏云金芽孢杆菌》（Bacillus thuringiensis）在系统发育上的密切关系，准确区分这两种细菌至关重要但具有挑战性。我们提出了一种结合蛋白质组学和脂质组学的策略，利用基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）技术来提高区分能力。通过优化培养基和提取方法，我们建立了一个包含7个菌株的内部参考库，并使用MALDI Biotyper进行亚型分析，克服了商业数据库的不确定性，将区分置信度提高到2.56至2.84之间。此外，我们开发了一种“单点、双采集”的工作流程，通过扩展的直接转移方法能够快速检测到1175、1191和1205 Da处的催吐毒素峰值，而无需额外的提取步骤。通过关联蛋白质组和脂质组学谱型，可以确定地区分《蜡样芽孢杆菌》和《苏云金芽孢杆菌》。这种分层方法克服了传统方法的分辨率限制，为快速鉴定密切相关的Bacillus物种和评估其毒力提供了一种变革性的、成本效益高的新途径，显著增强了公共卫生监测能力。

引言

Bacillus cereus属细菌呈杆状，革兰氏阳性，在自然界中普遍存在，常从土壤和食品中分离出来（Manzulli等人，2021；Takahashi等人，2022）。该属包含超过21个已知的物种，其中Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis在基因上最为相似（Ehling-Schulz等人，2019；Manzulli等人，2021；Takahashi等人，2020）。Bacillus cereus是一种机会性病原体，通常与两种食源性疾病相关，可引起腹泻和呕吐综合征（Chen等人，2024；D?uba?a等人，2021）。Bacillus thuringiensis》因其产生的晶体（Cry）和细胞裂解（Cyt）δ-内毒素而被广泛用作生物农药（Azizoglu等人，2025）。Bacillus cereus是主要的食品安全问题，在中国食源性病原体中排名第三（Paudyal等人，2018），在巴氏杀菌牛奶中的污染率约为27%（Meng、Liu等人，2022；Meng、Shen等人，2022）。然而，Bacillus thuringiensis也经常在新鲜水果、谷物甚至牛奶中被检测到（Chelliah等人，2019）。由于Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis的16S rRNA基因序列高度相似（>99%）（Carroll等人，2017），将每种细菌精确归因于特定的食源性疾病爆发非常具有挑战性（Allende等人，2016）。目前，无论是食品微生物学还是临床诊断方法都无法可靠地区分这两种细菌，也没有国际标准化组织（ISO）的通用鉴别方案（Chen等人，2022）。这种不确定性对食品安全的风险评估、系统发育分类学和人类健康构成了重大障碍。

已经投入了大量努力来区分Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis》。传统的基于培养的方法耗时且结果不确定，因为这两种细菌在形态和生化特征上几乎无法区分，通常需要长达48小时才能得到确认（Ha等人，2019；Ramarao等人，2020）。免疫测定法快速、灵敏，常用于食源性病原体的检测。例如，开发了一种模拟氧化酶介导的比率荧光酶联免疫吸附测定（ELISA），能够在43分钟内检测到Bacillus cereus（Meng、Liu等人，2022；Meng、Shen等人，2022）。然而，免疫测定法往往缺乏物种水平区分所需的特异性，并且在不同抗体批次之间存在变异性和重复性问题。分子方法，包括多重或实时荧光聚合酶链反应（PCR）和环介导等温扩增（LAMP），提供了更大的灵活性。实际上，已经提出了复杂的分子策略，利用多个遗传标记来区分不同样本基质中的Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis（Manzano等人，2009），这突显了这项任务的难度。尽管如此，分子方法仍然需要专业培训和大量人力，且成本较高。全基因组测序（WGS）通过识别特定的脂蛋白和甲基转移酶基因，提供了100%的特异性（Chelliah等人，2019）。然而，它仍然耗时，难以鉴定特定致病菌株的完整序列，不适合常规或便携式筛查。因此，迫切需要一种快速、成本效益高且高通量的方法来解决这些系统发育上的细微差异。

基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（MALDI-TOF MS）作为一种不可或缺的工具，通过将2-20 kDa范围内的主要光谱谱型（MSPs）与数据库中存储的参考蛋白质质量指纹（PMFs）进行比较，实现了快速微生物鉴定（Lebano等人，2024）。然而，Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis在该范围内的MSPs高度相似，标准PMF分析不足以实现可靠区分（Takahashi等人，2022）。尽管最近结合MALDI-TOF MS与基因组技术（如操纵子分析、WGS或基因组引导的挖掘）的方法提高了分辨率（Chen等人，2022；Muigg等人，2022；Takahashi等人，2020），但脂质组学分析的潜力尚未得到充分探索。除了蛋白质之外，微生物脂质还提供了多样而复杂的化学特征。使用MALDI-TOF MS的脂质质量指纹（LMF）在识别密切相关的微生物方面显示出潜力（Vera Solntceva等人，2021），例如ESKAPE病原体（Liang等人，2019）和分枝杆菌（Gonzalo等人，2021）。还有五种Bacillus物种通过在线MALDI-TOF MS结合LMF被鉴定出来（Shu等人，2012）；然而，该研究中没有包括Bacillus thuringiensis》。此外，MALDI-TOF MS也被用于检测产生催吐毒素的菌株和催吐毒素cereulide（Ducrest等人，2019；Takahashi等人，2022；Zeng等人，2024）。尽管取得了这些进展，但仍然缺乏一种系统的、综合的方法来同时区分Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis>，识别其产毒潜力并直接检测催吐毒素。

本研究旨在利用MALDI-TOF MS解决区分Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis的关键挑战。为此，我们首先提出了一种结合蛋白质组和脂质组学谱型的综合方法，该方法能够显著提高鉴定分辨率。我们建立了一个针对这些物种的内部参考库，并将其与商业MALDI Biotyper（MBT）系统集成，以扩展其分类覆盖范围。通过优化培养基、提取程序和基质类型，我们建立了一个升级的方案。该方案提供了三个层次的全面策略：区分Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis>，鉴定产生催吐毒素的Bacillus cereus，以及检测cereulide（图1）。该方法已成功应用于评估中国南部的Bacillus物种污染水平，证明了其作为快速且可靠的工具来区分密切相关物种的有效性。

部分摘录

菌株和材料

Bacillus cereus菌株（ATCC 14579、F4810、892-1）和Bacillus thuringiensis ATCC 10792由广东省科学院微生物研究所提供（广州，中国）。Bacillus cereus菌株（C04和C10）由香港理工大学提供（香港，中国）。Bacillus cereus菌株GW-1-1520-1920-02和Bacillus thuringiensis GYG来自广州微生物研究所（广州，中国）。Bacillus cereus菌株（BD1-1、BD1-2和YNB）由

培养基对Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis>区分的影响

使用四种培养基（LB、MYP、BHI和血琼脂）培养Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis，并使用EDT方法获得蛋白质质量指纹。所得到的MSPs显示在图2A中，商业数据库中的相应鉴定结果总结在表S1中。研究结果表明，培养基的选择显著影响了物种鉴定的可靠性。从高到低的准确性顺序为MYP、LB、BHI和血琼脂

结论

商业可用数据库的覆盖范围有限，这严重阻碍了Bacillus物种的准确鉴定。为了解决这一限制，我们建立了一个包含七个特征明确的菌株的内部参考库：五个Bacillus cereus和两个Bacillus thuringiensis》。利用MALDI-TOF MS的易用性和广泛采用，我们开发了一种综合的蛋白质组学-脂质组学工作流程，能够常规地区分Bacillus cereus和Bacillus thuringiensis

CRediT作者贡献声明

曾曦：撰写——原始草稿，研究，资金获取，数据管理，概念构思。王宇：撰写——原始草稿，验证，研究，概念构思。梅云佩：方法学，研究。贾宝珠：方法学，研究。王宏：可视化，概念构思。徐振林：撰写——审稿与编辑，监督，资金获取，概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。

致谢

本研究部分得到了中国广东省基础与应用基础研究重大项目（2020B0301030005）和中国广东省基础与应用基础研究基金会（2023A1515012605）的资助。