核桃谷蛋白溶解度的结构决定因素及其在食品工业中的应用潜力

《Food Research International》：Structural determinants of walnut glutelin solubility for enhancing food industry applications

通过计算饱和突变分析发现，核桃球蛋白仅1%的突变能提升水溶性且不影响结构稳定性，其中75个突变（<1%）同时优化两者。表面电荷引入和柔性区域靶向是关键策略，埋藏区域修改易破坏结构。该研究揭示了理性蛋白工程中表面电荷调控、结构完整性维护和精准突变靶点选择的优化原则。

　　

李毅|胡杰|臧家晨|唐宁

中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083，中国

摘要

核桃醇溶蛋白是一种主要的储存蛋白，但其固有的低溶解度给食品加工和营养应用带来了显著挑战。为了解决这一限制，我们对所有356个氨基酸位置进行了计算机模拟饱和突变实验，生成了6764个独特的单点突变，以寻找提高溶解度的策略。溶解度分析结果显示，绝大多数突变（97%）对溶解度的影响很小，只有1%的突变显示出有益效果。稳定性分析表明，溶解度和结构稳定性之间存在复杂的权衡关系，其中82%的稳定化突变反而降低了溶解度。值得注意的是，只有75个突变（不到所有测试突变的1%）同时改善了这两种性质，这突显了双重优化的严格限制。氨基酸组成分析显示，野生型醇溶蛋白中丝氨酸残基的含量较高，这是容易聚集的储存蛋白的特征，可以通过战略性替换为带电残基（尤其是赖氨酸）来达到最佳的溶解度提升效果。结构分析表明，有益突变主要发生在暴露在表面的区域，尤其是在柔性环和转角处，而埋藏在内部的区域由于结构破坏而不适合作为改造目标。化学分类分析证实，引入电荷的突变（特别是针对芳香族和可磷酸化残基的突变）是提高溶解度的最有效策略。基于序列和基于结构的方法的结合验证了关键的设计原则：引入表面电荷、通过选择性改造柔性区域来保持结构完整性，以及避免对埋藏残基的修改。这些发现为设计具有增强溶解度的核桃醇溶蛋白变体提供了合理的框架，同时保持了结构稳定性，为改善植物蛋白在食品中的应用提供了实用见解。

引言

由于消费者对可持续和健康食品的需求不断增加，植物基蛋白在食品工业中受到了广泛关注（Fu等人，2023年）。在各种植物蛋白来源中，核桃蛋白是一种未得到充分利用的资源，具有很大的功能性食品应用潜力（Wen等人，2023年）。核桃在全球范围内产量丰富，年产量超过400万吨，但在提取油脂过程中产生的富含蛋白质的核桃粉主要用于动物饲料，而非人类消费（Zhang等人，2024年）。核桃粉提取物的蛋白质组成包括四个不同的组分，根据其溶解性质进行分类：水溶性白蛋白（6.8%）、盐溶性球蛋白（17.6%）、酒精溶性蛋白（5.5%）和碱溶性醇溶蛋白（70.1%）。这种分类仍然是理解植物蛋白功能性的标准框架。然而，核桃蛋白中醇溶蛋白的占比过高给食品工业的应用带来了挑战。由于其固有的低水溶性，其在食品工业中的利用受到了严重限制。鉴于醇溶蛋白占总蛋白质含量的三分之二以上，提高其溶解度不仅是一个技术挑战，也是高价值利用核桃加工副产品的重要需求。因此，通过分子修饰来解决这一限制对于扩展核桃蛋白在水基食品系统中的应用至关重要（Liu等人，2023年）。

醇溶蛋白的特点是在碱性条件下才具有溶解性，它是许多植物物种中的主要储存蛋白。其中性pH值下的低水溶性极大地限制了其功能特性，包括乳化、发泡和凝胶形成等在食品应用中至关重要的性质（Ferreira & Castro，2023年；Zhao等人，2020年）。与水溶性白蛋白或盐溶性球蛋白不同，醇溶蛋白需要苛刻的碱性条件才能提取，这使得未经修饰的醇溶蛋白不太适合直接用于食品（Amagliani等人，2017年；Yang等人，2023年）。蛋白质溶解度的分子基础涉及氨基酸残基、蛋白质结构及其周围环境之间的复杂相互作用。疏水相互作用、静电作用、氢键和构象熵都对整体溶解度产生影响（Gao等人，2024年；Grossmann & McClements，2023年）。理解这些分子决定因素对于通过靶向修饰来增强蛋白质功能至关重要。最近在计算蛋白质分析方面的进展使得通过计算机模拟方法系统地研究蛋白质性质成为可能（Durham等人，2023年）。诸如NetSolP这样的工具可以准确预测突变对蛋白质溶解度的影响，而Rosetta和FoldX等结构分析平台则可以提供关于蛋白质稳定性和折叠动态的见解（Bu?等人，2018年；H?ie等人，2022年）。这些计算方法允许在不需要进行大量实验筛选的情况下全面探索蛋白质的序列-结构-功能关系。

本研究的主要目的是通过全面的计算分析来确定核桃醇溶蛋白溶解度的关键结构决定因素。我们假设特定的氨基酸残基和结构基序对醇溶蛋白的溶解度有重要影响，系统地识别这些决定因素将为合理的蛋白质工程提供目标。通过饱和突变分析，我们系统地识别并绘制了核桃醇溶蛋白溶解度的决定因素。这项研究填补了我们对核桃蛋白功能理解上的空白，并为提高其在食品工业中的应用提供了实用见解。这些发现将为未来的蛋白质工程工作提供参考，并有助于开发具有增强功能特性的改进型核桃蛋白成分。

部分内容摘要

蛋白质结构制备

核桃醇溶蛋白的氨基酸序列来自UniProt（条目ID：A0A2I4HVU8，B型5类似醇溶蛋白）。选择B型5类似醇溶蛋白作为研究对象，是因为它在核桃蛋白中的比例较高，确保预测的设计原则能够代表更广泛的醇溶蛋白群体（Zhou等人，2025年）。使用AlphaFold2和默认参数生成了三维结构模型（Jumper等人，2021年）。

整体溶解度情况

我们对核桃醇溶蛋白的所有356个氨基酸位置进行了计算机模拟饱和突变实验，生成了6764个独特的单点突变以供分析（图1和）。采用了两种互补的方法：基于序列的方法NetSolP和基于结构的方法SOuLMuSiC（Attanasio等人，2025年）。这项全面分析揭示了醇溶蛋白序列在不同突变下的溶解度响应存在显著差异。NetSolP的预测显示，绝大多数突变

结论

这项关于通过饱和突变提高核桃醇溶蛋白溶解度的综合计算分析揭示了蛋白质序列、结构、稳定性和溶解度之间复杂关系的基本原理。在6764个可能的替换中，只有75个突变同时改善了溶解度和稳定性，这突显了双重蛋白质性质优化的严格限制，并强调了所需的精确度

作者贡献声明

李毅：撰写——原始草稿、软件开发、方法设计、实验研究、数据分析、概念构思。胡杰：撰写——审稿与编辑、实验研究、数据分析。臧家晨：撰写——审稿与编辑、项目监督、资金筹集。唐宁：撰写——审稿与编辑、数据可视化、项目管理、资金筹集、数据分析、概念构思。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。

致谢

本工作得到了新疆维吾尔自治区中央科技发展引导基金（编号：ZYYD2025QY09）的支持。