《Protein Expression and Purification》：Comparison of the Efficacy of Cell Wall Disruption Methods for
Saccharomyces cerevisiae INVSc1 cells Expressing
Toxoplasma gondii Recombinant ROP6 Protein
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本研究比较了四种酵母细胞壁破碎方法对重组ROP6蛋白产率的影响，发现微流控和酸洗玻璃珠效率最优，液氮导致降解，Y-PER试剂虽产率低但稳定性好，为规模化生产提供参考。
Tu?ba Karakavuk | Muhammet Karakavuk | Ceren Gül | Hüseyin Can | Aytül Gul-Mete | Sedef Erkunt Alak | Aysu De?irmenci D??kaya | Seren Kaplan | ?rem Yavuz | Hasan Akbaba | Gül?ah Erel Akbaba | Ahmet Efe K?seo?lu | Tolga Ovayurt | Adnan Yüksel Gürüz | Cemal ün | Ay?e Gülten Kantarci | Mert D??kaya
埃格尔大学疫苗开发、应用与研究中心，土耳其伊兹密尔
摘要
弓形虫（Toxoplasma gondii）会感染人类和动物，导致严重的临床表现。由于缺乏安全的疫苗，开发一种安全有效的弓形虫病疫苗仍然是一个重要的需求。
酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是一种成熟的重组蛋白表达系统，具有公认的安全性。它支持翻译后糖基化，并被用于多种已获许可的疫苗中，包括乙型肝炎（Engerix-B）、人乳头瘤病毒（Gardasil）和疟疾（Mosquirix）疫苗。在
酿酒酵母中表达的重组
弓形虫蛋白已被研究用于疫苗配方。
然而，由于酵母细胞壁的坚固性，在下游处理过程中破坏细胞是一个主要挑战。在我们之前的工作中，
弓形虫重组ROP6蛋白已成功在
酿酒酵母 INVSc1细胞中表达，作为疫苗抗原，且使用微流控设备进行了细胞破坏。在这项研究中，我们比较了四种破坏方法（微流控设备、酸洗玻璃珠、液氮和Y-PER试剂）释放重组蛋白的效率。
结果表明，微流控设备和酸洗玻璃珠方法具有更高的细胞壁破坏效率，适合大规模生产。液氮方法会导致蛋白质过度降解，并存在安全性和可扩展性方面的挑战。尽管Y-PER试剂产生的rROP6蛋白量低于微流控设备和酸洗玻璃珠方法，但它通过减少多聚化和降解提供了良好的蛋白质稳定性，并且操作简便。
总体而言，破坏方法的选择应根据目标蛋白的特性、生产规模和成本考虑来优化产量和稳定性。
引言
重组或基于基因工程的生物技术疫苗（DNA、mRNA、重组蛋白和病毒载体）具有良好的安全性，并且能够加速开发和制造。其中，重组蛋白疫苗（也称为亚单位疫苗）被广泛研究，其中一些已经上市，例如HBV和HPV疫苗。这些疫苗仅包含病原体的某些抗原区域，在佐剂的帮助下能引发强烈的免疫反应，并且生产迅速且成本效益高。因此，许多研究集中在不同表达系统中表达具有抗原潜力的各种蛋白上。这些表达系统可以分为细菌、酵母、哺乳动物、昆虫和植物细胞系统，每种系统都有其优缺点。其中，酵母表达系统被广泛使用。酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae和毕赤酵母（Pichia pastoris）常用于重组蛋白表达。酿酒酵母被欧洲药品管理局（EMEA）和美国食品药品监督管理局（FDA）认定为最可靠的生物体（GRAS）[3]。
酿酒酵母一直是理解基本细胞过程的模式生物。这种单细胞、非致病性的酵母通过出芽方式生长。与细菌表达系统相比，它的最重要特点是翻译后修饰和正确的蛋白质折叠机制。在这种表达方式下，用于疫苗配方的重组蛋白以接近天然形式产生[4]。在某些情况下，使用基因工程对其进行改造和修饰。通过优化表达载体和启动子（GAL1、GAL2、TEF1和TPI1等），已在酵母中实现了高产蛋白的生产，这些因素提高了表达效率、蛋白质稳定性和环境适应性。选择性标记（URA3、LEU2等）有助于转化体的筛选[5, 6]。此外，酿酒酵母能抵抗极端条件，如低pH值、高渗透压和高糖浓度，这使其在工业规模应用中具有优势[7, 8]。
尽管有这些优点，使用酿酒酵母也存在一些挑战，其中最重要的是其高度耐久的细胞壁。细胞壁成分可能因酵母种类和环境条件而异[9]。酵母细胞壁具有由交联葡聚糖和几丁质组成的强内层，赋予结构刚性。外表面由甘露蛋白和多糖构成，决定了弹性和选择性通透性。因此，在下游处理过程中有效破坏细胞壁对于最大化蛋白质产量至关重要。为了释放酿酒酵母细胞中表达的重组蛋白，通常使用各种方法破坏细胞壁[10]。
先前的研究表明，物理方法（珠磨机、高压均质机、超声处理、电场、超临界二氧化碳）、化学方法（洗涤剂、溶剂等）和酶法（水解酶和自溶）常用于酵母细胞壁破坏[11]。选择合适的破坏方法对于提高蛋白质完整性和生物过程效率至关重要。
许多研究利用酵母来预防和治疗各种寄生虫疾病[12, 13, 14]。弓形虫（Toxoplasma gondii是其中最重要的寄生虫之一。它感染所有温血动物，包括人类，全球三分之一的人口被这种寄生虫感染[15, 16]。弓形虫病通常无症状；然而，在免疫系统较弱的人群中可能会发生严重并发症甚至死亡[17]。此外，弓形虫病也是绵羊、山羊和牛等具有高经济价值的家畜的重要健康问题[18]。目前有Toxovax疫苗可用，但它仅用于预防绵羊流产。这是一种减毒活疫苗，生产成本高且耗时。此外，它难以标准化，需要冷链运输，且突变株可能恢复为野生型并引起疾病[19]。因此，需要一种适用于人类和动物的有效疫苗。我们之前使用微流控设备在酿酒酵母 INVSc1细胞中表达了弓形虫 ROP6蛋白作为疫苗候选抗原[20]。在这项研究中，为了比较不同破坏方法下的蛋白质产量，再次在酿酒酵母 INVSc1细胞中表达了ROP6。除了微流控设备外，还使用了酸洗玻璃珠裂解、液氮和Y-PER试剂。通过相衬显微镜检查了细胞壁破坏情况，并使用SDS-PAGE和Western blot（WB）分析了亲和层析纯化的重组ROP6蛋白的产量。
在酿酒酵母 INVSc1细胞中表达重组ROP6蛋白
弓形虫 rROP6蛋白的表达方法如我们之前的研究[20]所述进行。根据
酿酒酵母 INVSc1细胞中。简而言之，为了使新鲜酵母细胞具备转化能力，先按照先前描述的方法用溶液I处理细胞，然后加入溶液II。接着向转化细胞中添加pYES2.1/ROP6质粒（2.5 μg/μL）。
结果
使用酸洗玻璃珠（图1）、微流控设备（图2）、液氮（图3）和Y-PER试剂（图4）破坏
酿酒酵母 INVSc1细胞壁的情况通过相衬显微镜、SDS-PAGE和Western blot进行了分析。根据每种方法处理前后的相衬显微镜图像，可以看出酸洗玻璃珠（图1A和1B）、微流控设备（图2A和2B）和液氮（图3A和3B）的破坏效果更好。
讨论
目前，重组蛋白表达市场非常广泛，包括多种表达系统[1]。在这些系统中，
大肠杆菌是最受欢迎的细菌宿主，因为它易于培养、生长迅速且遗传操作工具完善。然而，缺乏翻译后修饰以及内毒素的存在对大规模生产和制药应用构成了重大挑战[23, 24]。
CRediT作者贡献声明
Adnan Yüksel GüRüZ：撰写、审阅与编辑、验证、监督、概念设计。
Cemal üN：撰写、审阅与编辑、验证、资源提供。
Hüseyin CAN：撰写、审阅与编辑、验证、监督、数据分析。
Ay?e Gülten KANTARCI：验证、监督、资源提供。
Aytül GUL-METE：方法学设计、实验研究、数据分析。
Ceren GüL：方法学设计、实验研究、数据管理。
Mert D??KAYA：撰写、审阅与编辑、监督、项目管理。
参与同意书
不适用。本研究未涉及人类参与者。
发表同意书
不适用。本研究未涉及任何个人的数据或图像。
伦理批准
由于本研究未涉及人类参与者或动物，因此不需要伦理批准。
数据可用性
数据将按需提供。
资金支持
本研究部分得到了土耳其
埃格尔大学科学研究项目办公室的资助（资助编号：22890）。
利益冲突声明
作者声明没有利益冲突。
