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本研究综述了利用三维（3D）人工皮肤模型研究肌萎缩侧索硬化症（ALS）病理机制的新策略。模型结合3D生物打印与静电纺丝技术，模拟真实皮肤结构，并植入患者来源的成纤维细胞与神经元样细胞，成功揭示了疾病进程中焦亡（pyroptosis）关键通路（NLRP-3炎症小体/p-TDP-43）的激活及其相关生物标志物（IL-6, IL-18, 亚硝酸盐）的上调。该平台为减少侵入性活检、实现标准化疾病建模、生物标志物发现及临床前药物测试提供了创新性工具。
3D人工皮肤模型的构建与表征
为了克服传统皮肤活检的侵入性、重复取样需求及标准化困难等问题，研究团队开发了一种创新的三维（3D）人工神经支配皮肤模型。该模型通过巧妙结合两种先进的生物制造技术构建：利用3D生物打印技术加工甲基丙烯酰化透明质酸（MEHA）以模拟真皮/表皮结构，同时采用静电纺丝技术制备聚乳酸（PLLA）微纤维支架以模仿皮肤神经支配。这两种生物材料的选择基于其优异的生物相容性和仿生特性。MEHA作为一种可光交联的水凝胶，能提供类似细胞外基质（ECM）的柔软湿润微环境，而PLLA纤维则能引导神经样细胞的粘附与生长。两者复合形成的PLLA@MEHA结构在形态学上呈现出可控的多孔宏观架构与高度取向的微纤维网络，其溶胀行为、长达14天的结构稳定性以及接近天然人皮肤（10-50 kPa）的压缩模量，共同确保了其为细胞 colonization 和中期实验提供了理想的生理相关平台。
用于构建模型的细胞系表征
模型的细胞组分包括来自ALS患者皮肤活检的成纤维细胞和用于模拟神经支配的SH-SY5Y前神经元细胞系。在二维（2D）培养条件下，来自慢速进展型（S-ALS）和快速进展型（F-ALS）患者的成纤维细胞，与健康对照（HDF）相比，表现出增殖速率显著降低、细胞形态异常（如核仁增大、细胞体变大）以及成纤维细胞标志物（波形蛋白Vimentin和热休克蛋白47 Hsp47）表达的改变。特别是Hsp47信号增强，提示了无功能的纤维结缔组织的形成。更关键的是，蛋白质印迹分析显示，患者成纤维细胞中磷酸化TAR DNA结合蛋白43（p-TDP-43，ALS的关键病理蛋白）和NOD样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP-3，炎症小体的核心组件）的表达水平随疾病严重程度而增加。同时，经视黄酸分化的SH-SY5Y细胞呈现出典型的神经元样形态，并高表达神经元分化标志物GAP-43，证实其适用于模拟皮肤神经支配。
3D皮肤模型的生物相容性与细胞行为
将上述细胞共培养于PLLA@MEHA复合支架上7天后，评估模型的生物相容性。细胞活性实验证实，该3D模型支持所有细胞系的存活，并保持了2D培养中观察到的趋势：ALS患者成纤维细胞的活性低于健康对照，且快速进展型与慢速进展型之间也存在显著差异。荧光显微镜和扫描电镜（SEM）观察显示，不同来源的成纤维细胞在3D支架上保持了其特异的形态特征，并且与接种在PLLA纤维上的SH-SY5Y细胞形成了交互界面，成功模拟了体内神经支配皮肤中多种细胞类型的共存与相互作用。
焦亡与神经退行性生物标志物的表达
本研究的核心发现在于利用该3D模型揭示了ALS病理中焦亡通路激活与神经退行性变的关联。免疫荧光与图像分析表明，在ALS患者的3D人工皮肤中，p-TDP-43和NLRP-3的表达均显著上调。p-TDP-43作为一种神经退行性变标志物，其表达水平随ALS侵袭性增强而增加。同时，NLRP-3作为炎症小体活化的关键指标，其表达也与疾病严重程度正相关。这些结果首次在基于活体患者细胞构建的人类3D模型上证实，皮肤组织中存在与ALS神经退行性变相关的病理性TDP-43聚集和炎症小体激活，提示焦亡通路在疾病进程中扮演重要角色。
炎症小体激活相关的细胞因子产生
炎症小体激活会驱动caspase-1介导的促炎细胞因子成熟与释放。研究人员从3D皮肤模型培养体系中提取人工组织间液（ISF），检测其中焦亡相关的炎症介质。结果显示，亚硝酸盐（NO2-，一氧化氮代谢物）和白介素-6（IL-6）的水平随ALS严重程度（从慢速进展到快速进展）而升高。尤为重要的是，白介素-18（IL-18）的水平在慢速和快速进展型ALS患者的ISF中均显著高于健康对照，增幅达约10倍（从~60 pg mL-1增至~600 pg mL-1）。与传统的2D培养条件相比，3D模型在区分不同疾病进展速度患者的生物标志物谱（如亚硝酸盐和IL-18）方面更具敏感性，更能模拟体内复杂的细胞微环境相互作用。这些数据共同指出，IL-18可能是与ALS炎症小体激活密切相关的潜在疾病生物标志物。
结论与展望
综上所述，这项研究成功开发了一种患者来源的3D神经支配皮肤模型，该模型为在标准化条件下研究ALS病理生理学提供了一个生理相关的人类平台。模型不仅再现了疾病的关键特征，包括NLRP-3炎症小体通路激活和p-TDP-43聚集，还产生了富含焦亡相关介质（如IL-18）的组织间液。与2D培养相比，3D系统能更灵敏地区分疾病进展谱，并更好地模拟体内细胞相互作用。这项工作凸显了该平台在ALS生物标志物发现、疾病分层和临床前治疗测试方面的价值。在未来，这一策略有望支持开发旨在以微创方式监测疾病进展的皮肤生物传感器，从而减少诊断延迟，实现更个性化的患者管理。
