从计算机到传感器：一个结合β-视晶蛋白鱼类过敏原in silico设计、光学验证与电化学检测的概念验证型适配体平台

《ACS Sensors》：From Computer to Sensor: A Proof-of-Concept Aptamer Platform Combining In Silico Design, Optical Validation, and Electrochemical Detection of the Fish Allergen β-Parvalbumin

本文介绍了一种创新的鱼类主要过敏原β-视晶蛋白检测方法，即电化学适配体传感器。它巧妙地将in silico（计算机模拟）适配体筛选、荧光淬灭验证与电化学传感技术相结合。该研究成功开发出高灵敏度（检测限3.3 μg/mL）、高特异性的传感器，并在商业食品样本中验证了其可靠性，为食品安全监测提供了一种高效、精准的新工具。

　　

引言

食品安全是现代食品工业的核心关切，其中过敏原、毒素和病原体的存在对消费者健康构成重大风险。β-视晶蛋白是生鲜及加工鱼类食品中主要的钙结合蛋白过敏原，可引发敏感人群严重的过敏反应。因此，开发准确、灵敏的β-视晶蛋白检测方法对于预防过敏事件至关重要。电化学适配体生物传感器因高灵敏度、特异性和快速响应等优势，在生物分子检测领域展现出巨大潜力。适配体是短的单链DNA或RNA分子，能高亲和力地特异性结合目标分子。传统适配体筛选方法SELEX耗时费力，而_{in silico}（计算机模拟）方法通过机器学习、分子对接等技术，能大幅加速适配体发现与优化进程。

材料与方法

研究首先从鳕鱼（Merluccius merluccius）白肌及商业食品（婴儿食品、鱼形制品、鱼条）中纯化β-视晶蛋白。适配体筛选采用了两阶段机器学习流程：首先利用随机突变算法和变分自编码器生成6213个针对β-视晶蛋白的候选适配体序列；然后，通过图神经网络模型预测其与靶蛋白的结合亲和力（表观K_d），并基于预测的K_d、自由能变（ΔG）、二级结构和GC含量筛选出前30名候选者，最终选出APT10、APT19和APT29进行深入分析。通过Mfold服务器预测适配体二级结构，并利用3dDNA服务器构建其三维结构。靶蛋白β-视晶蛋白的三维结构则通过AlphaFold2生成。随后，使用HADDOCK软件进行_{ab initio}（从头）分子对接模拟，分析适配体-蛋白质复合物的相互作用及结合位点。in silico适配体筛选流程示意图、蛋白质接触图谱、静电势能图、三个适配体的序列比对以及它们的三维结构。">

体外验证采用基于荧光淬灭的适配体结合测定法。将标记了荧光基团Atto-MB2的适配体与标记了淬灭基团BHQ2的互补序列杂交。当靶蛋白β-视晶蛋白存在时，会与适配体结合并诱导其构象变化，从而释放互补序列，导致荧光恢复，以此验证适配体的结合能力与特异性。

电化学传感器构建方面，将筛选出的硫醇化适配体（APT29）与巯基己醇、m-PEG₄-硫醇混合，在金电极表面自组装成单分子层。使用PalmSens4恒电位仪进行电化学测量，通过循环伏安法和方波伏安法表征传感器性能。重点优化了SWV的工作频率，发现250 Hz下目标蛋白添加前后电流差异最大，因此选定为后续实验频率。

结果与讨论

_{in silico}结合与对接分析

计算机筛选出的6213个适配体，其预测K_d值介于7.67至369.30 nM之间。对接模拟显示，选出的三个适配体（APT10、19、29）均与β-视晶蛋白的特定区域结合。接触图谱分析表明，适配体19和29主要结合在蛋白的一侧，而适配体29的结合接触面积更大，且涉及更多残基。所有三个适配体的对接结果中，有19个残基是高度保守的，包括Asp10、Lys87等14个关键残基。这些相互作用揭示了带正电的赖氨酸倾向于与鸟嘌呤碱基及磷酸骨架作用，而天冬氨酸和谷氨酸则偏好与胞嘧啶作用。三维结构显示，适配体10和19具有假结结构，而适配体29呈现更紧密的自拥抱构象。

体外适配体-β-视晶蛋白结合评估

荧光测定结果明确显示，在pH 5.2的条件下，只有适配体29在加入β-视晶蛋白后表现出显著的荧光恢复，表明其发生了特异性的结构转换并成功结合目标蛋白。在pH 7.4的条件下，或使用其他适配体时，均未观察到明显的荧光恢复。选择性实验进一步证实，适配体29对β-视晶蛋白具有高度特异性，而对结构相似的牛奶过敏原β-乳球蛋白（β-Lact）几乎没有响应。研究者推测，在pH 5.2（接近β-视晶蛋白等电点）时，蛋白质表面电荷分布的变化可能优化了其与适配体之间的静电相互作用，从而提高了结合亲和力。

用于β-视晶蛋白检测的电化学适配体传感器的开发

电化学表征

频率扫描实验确定250 Hz为最优工作频率，此时目标蛋白存在与否的电流信号差异最大。特异性测试表明，仅当APT29与β-视晶蛋白结合时，才会引起电流显著增加。使用随机DNA序列或与β-乳球蛋白作用时，均无电流响应。这证实了信号变化源于适配体与目标蛋白结合后引起的构象变化，使标记在适配体末端的氧化还原探针（atto-MB2）更接近电极表面，从而加速电子转移。循环伏安法分析也证实，蛋白结合后电化学过程从扩散控制转变为表面控制，支持了构象变化的结论。

性能分析

通过测量不同浓度β-视晶蛋白下的电流变化百分比（i_%= [（i_target? i₀）/i₀] × 100），构建了校准曲线。该传感器在11.3 μg/mL至1.70 mg/mL的浓度范围内表现出良好的线性响应。计算得出的检测限为3.3 μg/mL，定量限为10 μg/mL。响应时间少于1分钟，体现了其快速检测的优势。

商业食品样本评估

为了验证传感器的实际应用能力，研究人员测试了三种市售鱼制品（婴儿食品、鱼形制品、鱼条）。通过提取样品中的肌浆蛋白并纯化β-视晶蛋白，使用该电化学传感器进行检测。结果显示，传感器对纯化提取物中β-视晶蛋白的定量结果与传统的Bradford蛋白测定法高度吻合（回收率分别为94.7%、87.4%和98.3%）。这充分证明了该传感器在复杂食品基质中检测β-视晶蛋白的准确性与可靠性。

结论

本研究首次成功开发了一种基于_{in silico}筛选适配体的电化学生物传感器，用于检测鱼类主要过敏原β-视晶蛋白。该工作整合了计算机辅助设计、体外荧光验证和电化学传感技术，建立了一个从理论设计到实际应用的完整平台。筛选出的适配体APT29在pH 5.2条件下对β-视晶蛋白展现出高亲和力与特异性。基于此构建的电化学传感器具有灵敏度高（LOD 3.3 μg/mL）、响应快速（<1分钟）、操作简便等优点，并在实际商业食品样本检测中证明了其有效性与准确性。这项研究成果为食品工业提供了一种强大的新工具，能够实现鱼类过敏原的快速、精准现场检测，对于保障食品安全、预防过敏事件以及满足日益严格的食品标签法规具有重要意义，有望革新现有的食品安全监测体系。