工程化改造的Trichoderma atroviride β-呋喃果糖苷酶增强低聚果糖合成效率

《Applied Microbiology and Biotechnology》：Enhanced fructooligosaccharides synthesis by engineered Trichoderma atroviride β-fructofuranosidase

本研究针对高效合成具有益生元应用潜力的低聚果糖(FOS)的需求，开展了对Trichoderma atroviride来源的新型β-呋喃果糖苷酶(TaINV)的鉴定、表征与改造工作。通过结构功能分析鉴定了决定FOS合成的关键催化残基，并利用定点突变获得了高转糖基活性的工程酶变体，其总FOS产率达到总糖的62.7%(w/w)，与商业酶水平相当。该研究为高效生产低聚合度FOS提供了新型、高效的生物催化剂。

　　

在追求健康生活的今天，益生元因其能够选择性促进肠道有益菌生长而备受关注。低聚果糖(FOS)作为一种重要的益生元，在食品和保健品工业中具有广泛应用前景。然而，高效、低成本地生产特定结构（尤其是低聚合度）的FOS，仍然是生物制造领域面临的一个挑战。目前，工业生产FOS主要依赖微生物来源的酶进行催化，但现有酶在催化效率、产物谱（即产生哪些特定结构的FOS分子）以及产率方面仍有提升空间。因此，挖掘具有新颖催化特性的酶，并通过工程化改造优化其性能，对于开发下一代FOS生产工艺至关重要。

为了应对这一挑战，研究人员将目光投向了一个丰富的微生物资源库——木霉属(Trichoderma)。尽管该属真菌在工业酶生产方面名声显赫，但其成员是否能产生用于合成FOS的β-呋喃果糖苷酶(β-fructofuranosidase)尚属未知。本研究首次从棘孢木霉(Trichoderma atroviride)中鉴定并表征了一种新型的β-呋喃果糖苷酶，命名为TaINV。研究人员致力于回答几个核心问题：TaINV的基本酶学性质如何？它能合成哪些类型的FOS？其催化功能背后的结构基础是什么？能否通过理性设计对其改造，以进一步提升FOS合成能力？这项研究不仅旨在扩充糖苷水解酶32家族(GH32)的多样性知识，更希望为高效生产具有潜在益生元应用的低聚合度FOS找到一种有前途的生物催化剂。相关成果已发表于《Applied Microbiology and Biotechnology》期刊。

为开展本研究，作者运用了几个关键技术方法：首先，对棘孢木霉(Trichoderma atroviride)来源的TaINV基因进行异源表达与蛋白纯化，获得用于生化分析的重组酶。其次，对纯化后的TaINV进行系统的生化表征，分析其底物特异性、水解与转糖基化活性。再者，利用AlphaFold2预测了TaINV的三维结构模型，并通过与已知的GH32家族酶-底物复合物结构进行比对，进行结构-功能分析，以推测关键的底物结合与决定特异性的残基。最后，基于上述分析，对候选残基进行定点突变，构建并表征了一系列TaINV变体，以验证关键残基功能并筛选性能提升的突变体。本研究未涉及样本队列。

研究结果

一种来自Trichoderma atroviride的新型β-呋喃果糖苷酶的鉴定与表征

研究人员成功从Trichoderma atroviride中克隆了TaINV的基因，并在异源系统中表达、纯化了该酶。生化分析表明，TaINV具有水解活性，其主要底物是蔗糖以及其他含有β-(2→1)糖苷键的底物，对含有β-(2→6)键的底物活性较低。更重要的是，除了水解活性，TaINV还能催化合成所有三种结构系列的低聚果糖(FOS)，即¹F-FOS、⁶F-FOS和⁶G-FOS。在最大生产点时，TaINV合成了252 g/L的总FOS，占反应混合物中总糖的50.3% (w/w)，其中1-酮糖(1-kestose)是主要产物，约占合成产物总量的85%。这些结果表明TaINV是一种具有强转糖基化能力、且偏好合成短链FOS的独特胞内真菌β-呋喃果糖苷酶。

基于结构预测的催化机理与特异性残基分析

为了理解TaINV催化功能的结构基础，研究人员利用AlphaFold2预测了TaINV的三维结构模型。将该模型与已表征的GH32家族酶-底物复合物结构进行比对分析，揭示了保守的催化基序和残基。这些残基位于与GH32酶中底物结合和特异性相关的位置。分析确认了催化三联体(Asp63, Asp201, Glu277)的存在，并识别出可能影响转糖基化特异性的其他残基。

通过定点突变工程化改造TaINV以提升FOS产率

基于结构-功能分析，研究人员对推测的关键残基进行了定点突变，以验证其功能并尝试改进酶的性能。实验证实了催化三联体(Asp63, Asp201, Glu277)对酶活性的必要性。同时，研究发现包含W60Y和N62S substitutions的变体显著提高了总FOS的产率。W60Y变体使总FOS达到总糖的62.7% (w/w)，N62S变体达到57.4% (w/w)。这些产率与商业用酶所获得的产率相当，表明通过理性设计成功增强了TaINV的转糖基化能力。

研究结论与意义

本研究首次报道并深入表征了来自木霉属(Trichoderma)的首个能够合成低聚果糖(FOS)的β-呋喃果糖苷酶——TaINV。该酶展现出了强大的转糖基化活性和对短链FOS的合成偏好。通过结合AlphaFold2结构预测与比较结构分析，研究揭示了TaINV的催化机制，并识别出超出经典催化三联体之外、对塑造其转糖基化特异性至关重要的残基。在此基础上，通过定点突变成功对TaINV进行了工程化改造，获得的变体（如W60Y）将总FOS产率提升至总糖的62.7%，达到了与商业酶制剂相媲美的水平。

这项工作的意义在于多个层面。首先，它显著拓展了我们对GH32家族酶多样性的认知，发现了一个具有独特催化特性的新成员。其次，它通过将计算结构生物学与酶工程技术相结合，成功实现了一种新型生物催化剂的性能定向进化，为理性设计改造酶提供了范例。最重要的是，本研究开发出的高性能TaINV变体，为高效、绿色地生产具有潜在益生元应用价值的低聚合度FOS提供了一种极具潜力的新型生物催化剂，在功能食品和保健品等领域具有明确的应用前景。