《Lab on a Chip》：High-throughput single-cell proteomics and transcriptomics from same cells with a nanoliter-scale, spin-transfer approach
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本文介绍了名为nanoSPINS的新型平台，它通过一种创新的离心自旋转移方法，实现了从同一单细胞中进行高通量的蛋白质组学和转录组学平行分析。该平台巧妙地将TMTpro多重标记蛋白质组学与基于液滴的scRNA-seq技术结合，不仅解决了先前技术（如nanoSPLITS）通量较低的瓶颈，还通过优化裂解、蒸发和转移步骤，有效实现了mRNA与蛋白质在纳升级尺度下的高效、高保真分离。该研究在两种细胞系（C10和SVEC）上验证了平台在鉴定细胞类型特异性分子特征方面的强大能力，为深入探索细胞异质性和生物标志物发现提供了有力工具。
文章内容归纳
引言
多细胞系统在细胞间和细胞内层面都展现出巨大的复杂性。对细胞中mRNA和蛋白质等生物分子的量化，对于理解细胞类型、状态及其对各种刺激的响应至关重要。近年来，单细胞组学技术，特别是全局性的单细胞转录组学和基于质谱的单细胞蛋白质组学，都取得了显著进展。然而，单一模态的测量只能提供细胞状态的片面视图，因此，能够并行连接不同模态的单细胞多组学测量变得至关重要。尽管已有一些平台能够实现从同一细胞中同时分析转录组和蛋白质组，如nanoSPLITS，但其基于无标记蛋白质组学的流程通量相对较低，难以匹配常规可检测数万至数十万细胞的单细胞转录组学实验。为了解决这一瓶颈，本研究开发了一个名为nanoSPINS的新型平台，它通过整合基于TMTpro多重标记的高通量蛋白质组学与基于条形码的单细胞转录组学，实现了从同一单细胞中获取高信息量的平行多模态数据。
结果
nanoSPINS方法原理与设计
为了提升单细胞多组学的通量，nanoSPINS整合了用于多重蛋白质组学的嵌套nanoPOTS技术和用于多重转录组学分析的cellenCHIP 384。其核心工作流程是通过离心力，将含有mRNA的液滴从最初的nanoSPINS芯片转移到接收芯片cellenCHIP 384中，而蛋白质则被保留在原始芯片上。具体而言，单个细胞首先被分选到已预装裂解和透化缓冲液的nanoSPINS芯片上，在透化处理后，液滴经过蒸发、再水化，然后通过高速离心，将mRNA转移至下层芯片，用于后续的单细胞转录组测序文库构建。而保留在nanoSPINS芯片上的细胞沉淀则进行后续的胰蛋白酶消化和TMTpro标记，用于高通量的多重单细胞蛋白质组学分析。
阵列间纳升级液滴的大规模离心转移
在前期nanoSPLITS技术中，mRNA和蛋白质通过手动合并并分割两个液滴来实现分离，但这种方式不兼容具有凹陷纳米孔的cellenCHIP。为解决此问题，nanoSPINS设计了一种与cellenCHIP 384孔距匹配的原型芯片，并包含3×3阵列，可用于对最多9个细胞进行TMTpro标记。实验证明，通过离心，40nL的荧光素样品液滴能够成功地、无交叉污染地从nanoSPINS芯片的所有192个孔完全转移到cellenCHIP 384中。
洗涤剂介导的透化促进mRNA释放同时保留细胞蛋白质
为了理解细胞裂解机制，研究团队复现了nanoSPLITS流程。荧光显微成像结果显示，在不添加去垢剂DDM的情况下，细胞膜在低渗溶液诱导下破裂，产生弥散的荧光。而添加0.1% DDM后，这种弥散荧光消失，表明DDM通过渗透细胞膜，允许胞质可扩散成分如mRNA和蛋白质进入液滴，而细胞主体大部分仍完整地附着在芯片表面。这一观察解释了为何蛋白质大部分保留在原始芯片上。进一步的离心实验表明，0.1% DDM的存在显著增强了细胞物质在芯片表面的保留率。此外，关键的蒸发步骤被证明是保留细胞核（非溶解的细胞物质）的决定性因素，引入蒸发步骤后，离心后细胞核保留率从18.5%提高到了99%。因此，优化的nanoSPINS流程纳入了几个关键步骤来实现细胞物质的不对称分离，包括使用0.1% DDM细胞裂解缓冲液，并在离心转移液滴前加入蒸发和再水化步骤。
优化的nanoSPINS工作流程实现对两种细胞群的平行表征
在完全优化方法后，研究对nanoSPINS芯片上保留的单细胞进行了TMTpro单细胞蛋白质组学分析，并对转移到cellenCHIP-384中的细胞裂解物进行了单细胞转录组测序分析。经过质控，从160个蛋白质组高质量细胞中平均鉴定出1186个蛋白质，且C10和SVEC细胞在蛋白质水平上显示出高度的可重复性。主成分分析能够清晰地将两种细胞类型区分开。与未经历分裂过程的直接分选细胞相比，nanoSPINS细胞平均鉴定的蛋白质数量减少了约500个，但这种覆盖度的降低是普遍性的蛋白质输入损失，而非特定蛋白的特性。在转录组学方面，经过质控的139个高质量细胞平均每个细胞检测到约3655个基因。尽管与直接分选的完整细胞相比，nanoSPINS细胞平均检测到的基因数量几乎减少了一半，但98.61%由nanoSPINS检测到的基因也在直接分选细胞的转录组谱中存在，证明该流程没有引入显著的转录组假象。两种模态的比较显示，高质量细胞中鉴定出的蛋白质有89.8%在转录组中也有检出。对C10和SVEC细胞转录组和蛋白质组谱的差异丰度分析揭示了两者之间差异表达的mRNA和蛋白质，其中仅有少量基因-蛋白质对在两种模态中均显示出相似的表达丰度变化趋势，凸显了并行多模态测量对高置信度生物标志物发现的重要性。2FC| ≥ 1, adjusted p < 0.05) and proteins (|log2FC| ≥ 0.5, adjusted p < 0.05) from the comparison between C10 and SVEC single cells. Dark green and indigo represents significant differentially expressed genes and proteins in C10 cells vs. SVEC single cells identified from scRNA-seq and scProteomics analysis. (C) Volcano plots showing the distribution of significantly differentially expressed genes and proteins between C10 and SVEC cells. Significance thresholds were set at |log2FC| ≥ 1 (for genes) and |log2FC| ≥ 0.5 (for proteins) with adjusted p < 0.05. p-Values were corrected for multiple testing using the Benjamini–Hochberg method.">
讨论与结论
为实现高通量的单细胞转录组和蛋白质组全局测量，研究首先深入理解了nanoSPLITS中的细胞裂解机制。研究发现，去垢剂DDM的存在能显著影响细胞在低渗缓冲液中的裂解方式，其通过渗透细胞膜，允许可扩散的胞质分子进入纳升级液滴。基于此观察，并为了整合cellenCHIP 384，研究开发了离心转移的方法。其中，液滴蒸发是关键步骤，它能确保细胞物质保留在芯片表面用于蛋白质组学分析，同时允许可溶性成分（如mRNA）在离心时被转移用于转录组测序。蒸发可能导致溶质浓度增加和蛋白质分子更容易接触到气-水界面，从而引发蛋白质变性聚集，减少其在再水化步骤中的溶解。nanoSPINS方法的一个主要优势是显著提升了从同一单细胞进行多组学测量的通量，相较于之前的nanoSPLITS平台提升了最高8倍。通过一次nanoSPINS转移分析96个C10和96个SVEC细胞，平均每个单细胞可检测到约1186个蛋白质和3646个基因。尽管多模态特征的覆盖度相对于未经历转移的直接分选细胞有所降低，但数据的质量和重现性依然很高。蛋白质组学和转录组学分别在单细胞间显示出约0.94和约0.64的平均皮尔逊相关系数，中位变异系数分别为0.27和0.38，表明该流程能够产生与已发表结果相媲美的高质量数据。重要的是，研究不仅验证了先前报道的C10和SVEC细胞的细胞类型特异性蛋白标志物，还首次在转录水平上证明了这些标志物的细胞特异性富集。这些发现强调了并行多模态测量对于高置信度生物标志物发现和跨模态应用的重要性，验证了nanoSPINS方法的有效性，并展现了多模态单细胞分析在生物标志物发现领域的巨大潜力。
