高温响应信号通路解析：LsMAPK6磷酸化LsCO增强蛋白稳定性与转录活性以促进生菜高温抽薹

《Plant Biotechnology Journal》：LsMAPK6 Phosphorylates the LsCO Protein to Enhance Its Stability and Transcriptional Activity, Promoting Floral Transition Upon High Temperatures in Lettuce

高温是制约生菜生产的主要逆境，常导致其过早抽薹开花，造成严重减产。本研究发现，高温诱导的丝裂原活化蛋白激酶LsMAPK6，可通过磷酸化核心开花整合子LsCO蛋白的Ser-258位点，从而增强LsCO的蛋白稳定性及其转录激活能力，进而上调下游成花素基因LsFT的表达，最终驱动生菜高温抽薹。该研究揭示了LsMAPK6-LsCO-LsFT信号模块精细调控生菜高温诱导抽薹的新机制，为培育耐热、晚抽薹生菜新品种提供了关键分子靶点。

　　

全文内容归纳

1. 引言

生菜（Lactuca sativa L.）作为全球广泛消费的叶菜，其可食用的莲座叶是其主要的商品器官。然而，生菜是一种喜冷凉气候的作物，高温环境，特别是我国夏季的气候条件，会显著加速其从营养生长向生殖生长的转变，即提前发生抽薹和开花。这种提前抽薹会停止叶片生物量的积累，导致品质下降（如叶片苦味增加），并造成巨大的经济损失。因此，解析高温诱导抽薹的遗传与分子调控机制，对于培育耐热、晚抽薹的生菜品种至关重要。

开花转变是植物生命周期中的关键步骤，受到内源信号（如开花激素、植株年龄）和环境信号（如光周期、温度）复杂网络的精密调控。在拟南芥等模式植物中，转录因子CONSTANS（CO）是整合光周期信号的核心枢纽，在长日照条件下通过激活成花素基因FLOWERING LOCUS T（FT）的表达来促进开花。CO蛋白的活性，特别是其稳定性，受到翻译后修饰，尤其是磷酸化的精细调控。例如，拟南芥中的糖原合成酶激酶3（GSK3s）可通过磷酸化CO蛋白促进其经由COP1 E3泛素连接酶途径降解，从而在非诱导条件下延迟开花。在生菜中，前人研究发现，生长素响应因子LsARF3通过直接激活LsCO表达来介导热诱导抽薹，表明生长素通路在生菜抽薹中具有重要作用。同时，LsFT的表达也在热胁迫下上调。然而，在生菜中，是否存在特定的激酶模块响应高温并直接调控开花关键因子的活性，尚不完全清楚。

丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）级联反应是进化上保守的信号转导模块，能够将环境信号和发育信号转化为细胞反应。在植物中，MAPK6是响应非生物胁迫（如干旱、盐分和极端温度）的核心组分之一。在生菜中，高温处理茎尖的转录组分析显示，MAPK信号通路被激活，暗示其在热胁迫响应和抽薹过程中可能扮演重要角色。尽管GSK3激酶已被证实调控拟南芥CO的稳定性，但不能排除其他激酶（如MAPK6）在生菜或其他植物的抽薹开花过程中发挥特定作用。

2. 结果

2.1 LsMAPK6的表达与磷酸化受高温强烈诱导

LsMAPK6是拟南芥MAPK6在生菜中的同源基因。表达模式分析显示，LsMAPK6在生菜的营养器官和生殖器官中均有表达，尤其在茎和茎尖中表达丰度最高，暗示其可能在茎伸长和分化中发挥作用。进一步研究发现，高温处理能显著增强茎尖中LsMAPKK6的转录水平，并在处理8天后达到峰值。蛋白质免疫印迹分析证实，不仅LsMAPK6蛋白的积累量随高温处理时间延长而增加，其磷酸化形式的蛋白水平也相应升高。这些结果表明，高温在转录和翻译水平上均能强烈诱导LsMAPK6的表达，并且磷酸化的LsMAPK6可能与生菜的开花转变相关。

2.2 敲除LsMAPK6延迟生菜高温下的开花转变

为了探究LsMAPK6的功能，研究者利用CRISPR/Cas9基因编辑技术创建了lsmapk6突变体。在高温条件下，与野生型（WT）相比，多个独立的lsmapk6突变体株系表现出抽薹、现蕾和开花时间的显著延迟，同时茎长也明显短于WT。茎尖的显微镜观察发现，在高温处理8天后，WT植株的茎尖已呈现扁平圆形，表明花序分生组织（IM）的早期分化已经开始；而lsmapk6突变体的茎尖仍为突出形状，被叶原基包裹，未见花原基，表明其仍处于营养生长阶段。这些结果证明，缺失LsMAPK6会显著延迟生菜在高温下的抽薹。

2.3 过表达LsMAPK6促进生菜抽薹开花

研究者还获得了三个独立的LsMAPK6过表达（OE）株系。在常温条件下，这些过表达株系的抽薹、现蕾和开花时间均显著早于WT植株，茎长也明显更长。茎尖显微结构分析显示，在播种后52天，WT植株茎尖仍为凸出的半球形，而未启动开花转变；而所有LsMAPK6-OE株系的茎尖均已变为扁平形状，叶原基包裹着IM，表明已启动开花转变。此外，关键开花基因（如LsCO、LsFT、LsSOC1和LsLFY）的转录水平在LsMAPK6-OE株系中上调，在lsmapk6突变体中下调。有趣的是，田间实验表明，LsMAPK6的敲除并未对单株鲜重、产量、千粒重和结实率等农艺性状产生显著负面影响，暗示lsmapk6突变体是培育抗抽薹生菜种质的潜在材料。

2.4 LsMAPK6蛋白与LsCO相互作用

为了探索LsMAPK6促进抽薹的分子机制，研究者以LsMAPK6为“诱饵”，筛选生菜茎尖cDNA酵母双杂交（Y2H）文库，并鉴定到一个与拟南芥CONSTANS（CO）高度相似的B-box转录因子，将其命名为LsCO。一对一Y2H实验证实了LsMAPK6与LsCO之间存在特异性互作。亚细胞共定位显示，LsMAPK6-GFP和LsCO-RFP融合蛋白在烟草细胞核中共定位。进一步的免疫共沉淀（Co-IP）、萤光素酶互补（LCA）和双分子荧光互补（BiFC）实验均从不同角度在植物体内验证了LsMAPK6与LsCO的直接相互作用。这些发现强有力地表明，LsMAPK6与LsCO在体内形成蛋白复合物。

2.5 LsMAPK6磷酸化LsCO的Ser-258位点以增强其稳定性

接下来，研究者探究了LsCO是否是LsMAPK6的底物。Phos-tag凝胶迁移实验和抗磷酸化丝氨酸/苏氨酸抗体检测均显示，在LsMAPK6-OE株系中，LsCO的磷酸化水平升高，而在lsmapk6突变体中则降低，表明LsCO的磷酸化在很大程度上依赖于LsMAPK6激酶。体外激酶实验证实，组成型激活的CA-LsMAPK6能够在体外磷酸化重组LsCO蛋白。通过液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析，研究者进一步确定了LsMAPK6对LsCO的磷酸化位点为第258位的丝氨酸（Ser-258）。序列比对显示，该位点在拟南芥和生菜的CO及CO-like蛋白中相对保守。

由于磷酸化常影响蛋白稳定性，研究者进行了细胞游离降解实验。结果表明，在野生型背景下，LsCO蛋白在lsmapk6突变体提取物中的降解速度更快，而在LsMAPK6-OE株系提取物中则与WT相似。更重要的是，与野生型LsCO或磷酸化缺陷型突变体LsCO^S258A相比，磷酸化模拟型突变体LsCO^S258D在WT背景下的蛋白积累水平更高，稳定性更强。在添加蛋白酶体抑制剂MG132后，所有形式的LsCO降解均被抑制。综上所述，LsMAPK6通过对LsCO Ser-258位点的磷酸化，增强了LsCO蛋白的丰度和稳定性。

2.6 LsCO是生菜开花转变的正调控因子

表达分析显示，LsCO在生菜的花器官和茎尖中高表达，且其转录和蛋白水平均受高温诱导上调。在LsMAPK6转基因株系中，LsCO蛋白的积累模式与LsMAPK6一致。功能验证表明，利用CRISPR/Cas9敲除LsCO会导致生菜在高温下抽薹、现蕾和开花延迟，茎尖分化滞后；而过表达LsCO则能加速这些过程。因此，LsCO与其在拟南芥中的同源蛋白一样，是生菜开花转变的正调控因子。

2.7 LsMAPK6与LsCO协同调控生菜抽薹

为了探究LsMAPK6与LsCO之间的遗传互作，研究者在LsMAPK6-OE植株背景下，瞬时上调或下调了LsCO的表达。结果显示，在LsMAPK6-OE背景下进一步过表达LsCO（LsMAPK6-OE/LsCO^OE）能更显著地促进茎的伸长；反之，瞬时沉默LsCO（LsMAPK6-OE/LsCO^SL）则部分回补了LsMAPK6过表达导致的早抽薹表型。同时，LsFT的表达水平与LsCO的表达变化正相关。这些结果表明，LsMAPK6可能通过调控LsCO的表达和蛋白稳定性来促进茎的伸长，而LsFT可能是LsCO的下游靶标，三者协同调控生菜抽薹。

2.8 LsMAPK6磷酸化LsCO增强其转录活性，通过LsCO-LsFT信号级联促进开花转变

酵母单杂交（Y1H）和双萤光素酶报告基因实验证实，LsCO能够直接结合到LsFT启动子区的特定顺式作用元件（CORE2-2）上，并激活其转录。为了评估LsCO磷酸化对其转录活性的影响，研究者构建了LsCO^S258D（磷酸化模拟）和LsCO^S258A（磷酸化缺陷）突变体进行双萤光素酶实验。结果表明，单独的LsMAPK6或LsCO^S258A无法激活LsFT启动子，共转LsMAPK6和LsCO^S258A同样不能激活。然而，单独的LsCO^S258D就能显著激活LsFT启动子，其激活强度与LsCO + LsMAPK6或LsCO^S258D+ LsMAPK6的组合相当。这些观察强有力地说明，LsMAPK6对LsCO Ser-258位点的磷酸化，对于LsCO激活下游LsFT转录的能力至关重要。

3. 讨论与展望

本研究揭示了一条全新的高温诱导生菜抽薹的信号通路：高温激活LsMAPK6的表达与磷酸化；活化的LsMAPK6与核心开花整合子LsCO相互作用，并磷酸化其Ser-258位点；该磷酸化修饰一方面增强了LsCO蛋白的稳定性，使其在高温下得以积累，另一方面也提升了LsCO的转录激活能力；积累的、高活性的磷酸化LsCO进而强力驱动其直接靶标——成花素基因LsFT的表达，最终启动生菜的开花转变程序，导致提前抽薹。

该研究的发现具有重要的理论与应用价值。在理论上，它首次将MAPK信号通路与植物开花转变的核心调控因子CO直接联系起来，阐明了MAPK6通过磷酸化修饰精确调控CO蛋白稳定性与活性的新机制，拓展了人们对植物整合温度信号控制发育时序的理解。在应用上，该研究鉴定到的LsMAPK6和LsCO基因，尤其是其磷酸化位点，为分子设计育种提供了关键靶点。通过基因编辑技术适度调控LsMAPK6的活性或利用磷酸化模拟策略，有望培育出在高温环境下仍能保持良好商品性（晚抽薹）的生菜新品种，这对于应对全球气候变化背景下的蔬菜稳产保供具有重要意义。研究中获得的lsmapk6突变体在未牺牲主要农艺性状的前提下实现了晚抽薹，更是展示了其直接应用于育种的巨大潜力。