《Journal of Environmental Sciences》：Species-Specific molecular mechanisms of DEHP toxicity in earthworms revealed by integrated transcriptomics and metabolomics
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两种蚯蚓对DEHP毒性反应的分子机制比较研究：以E. foetida和M. guillelmi为例，通过整合组织病理学、残留分析和多组学技术，发现M. guillelmi在分子层面更敏感，其代谢紊乱和转录塑性显著高于E. foetida，提示生态策略差异影响生物可利用性及毒性响应。
王俊|卢班-宗迪·布达扎波夫|孔文佳|姜楠|景贤月|高建鹏|孙洪达|冯文超|姚向峰|李贤旭
山东农业大学资源与环境学院，农业环境重点实验室，中国泰安271018
摘要
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）在农业生态系统中普遍存在；然而，土壤碎屑食者在不同物种中的具体毒性机制尚未明确。本研究采用组织病理学、残留分析、转录组学和代谢组学相结合的综合方法，探讨了DEHP对两种蚯蚓物种Eisenia foetida和Metaphire guillelmi的毒性作用机制。DEHP在两种蚯蚓中均引起了显著的组织损伤，其中M. guillelmi的损伤更为严重。尽管M. guillelmi体内的DEHP残留量略低于E. foetida，但其分子层面的紊乱更为明显，表明其敏感性更高，这与体内的DEHP负荷无关。这些差异可能反映了两种蚯蚓在生态策略上的差异，从而影响了其对DEHP的生物利用性和生理反应。转录组学分析发现M. guillelmi有2673个差异表达基因，而E. foetida仅有138个差异表达基因，显示出两者在转录可塑性上的显著差异。代谢组学分析也显示M. guillelmi的代谢紊乱更为广泛（138个差异代谢物），而E. foetida仅有30个差异代谢物）。整合路径分析表明，DEHP主要干扰了E. foetida的亚油酸代谢和催产素信号通路，而在M. guillelmi中则主要影响脂质、氨基酸以及嘌呤/嘧啶代谢。这些变化与氧化应激、免疫失衡和能量代谢紊乱相关。来自组学和组织病理学的研究结果共同表明，DEHP的毒性作用具有物种特异性，M. guillelmi在分子层面更为敏感。总体而言，这些发现为基于效应的土壤健康评估和物种敏感性的生态风险评价提供了机制性生物标志物和证据。
引言
数以万计的合成化学物质及其转化产物被用于日常包装材料中，极大地提高了现代生活的便利性（Wang等人，2020年）。其中，增塑剂是一类重要的化学物质，被广泛添加到各种塑料产品中以提升产品的柔韧性、强度、可塑性和耐用性（Benjamin等人，2015年；Liu等人，2024年）。邻苯二甲酸酯（PAEs）作为一类常见的增塑剂，因其成本效益和优异的性能而广泛使用，占全球增塑剂市场的约85%，在中国这一比例甚至高达90%（Li等人，2023b年）。研究表明，PAEs通过氢键或范德华力附着在材料表面，容易从材料中释放并渗入周围环境（Huo等人，2022年；Net等人，2015年）。有预测指出，到2022年，全球对PAEs的需求年均增长率将超过1.3%（Luo等人，2018年）。然而，尽管已采取措施识别和降低这些化学物质的风险，它们仍持续释放到土壤和水等生态系统中（Zhang等人，2024年）。
邻苯二甲酸二(2-乙基己基)酯（DEHP）是最常用的高分子量PAEs之一，被广泛用于塑料农膜、玩具和食品包装等产品中（Benjamin等人，2015年；Liu等人，2022年）。据统计，DEHP占欧盟总PAE产量的约30%，在中国这一比例高达80%（Net等人，2015年）。据估计，超过70%的DEHP在塑料产品的整个生命周期中释放到土壤中，导致土壤生态健康受到严重威胁（Gao等人，2018年；Li等人，2023b年）。土壤中DEHP的浓度通常在几微克/千克到几毫克/千克之间，存在较大的空间变异性（Zhu等人，2018年）。例如，在中国山东省寿光市进行的一项研究显示，设施农业土壤中的DEHP浓度范围为77.75至1004微克/千克（附录A 表S1）（Li等人，2020年）。在黄河三角洲，盐碱土壤中的DEHP浓度为0.043至6.387毫克/千克（Liu等人，2023年），而在中国新疆和襄阳的棉田土壤中，DEHP浓度高达100毫克/千克（Guo和Wu，2011年；Wu等人，2015年）。随着DEHP在陆地生态系统中的不断积累，这对土壤健康构成了日益严重的生态挑战，尤其是对土壤生物的影响可能非常严重。
渗入土壤的DEHP会显著影响土壤微生物群落和功能结构，改变植物生长，并破坏土壤动物的生存。先前的研究表明，DEHP会对蚯蚓产生不良影响，包括引发氧化应激、抑制生长和破坏肠道菌群（Li等人，2023a，2024年）。这些结果表明，不同蚯蚓物种对DEHP的反应存在差异。最近的一项研究考察了DEHP对多种土壤生物（包括两种植物Vigna radiata和Oryza sativa以及四种动物Eisenia andrei、Chlamydomonas reinhardtii、Folsomia candida和Lobella sokamensis）的毒性作用，发现DEHP的生态风险具有物种特异性，对动物的影响比对植物的影响更为明显（Kim，2019年）。然而，这些结论主要基于传统的生理和生化指标，而DEHP毒性的分子机制（特别是在基因表达和代谢物调节层面）尚未得到系统研究。转录组测序和代谢组学的最新进展为研究环境污染物的生态毒性机制提供了强大的高分辨率工具（Jia等人，2023年；Zhang等人，2023年）。这些技术有助于揭示环境压力下生物反应的分子机制，包括基因表达和代谢物谱的变化。因此，这些方法越来越多地应用于环境毒性评估，以阐明污染物效应的机制途径（Li等人，2022b年）。例如，转录组和代谢组数据的综合分析表明，暴露于低密度聚乙烯微塑料的蚯蚓会重新分配能量代谢途径以应对氧化应激并增强解毒能力，最终导致生长抑制（Zhao等人，2024年）。类似地，整合组学分析发现，高剂量的锑会显著改变蚯蚓中与氧化磷酸化相关的代谢物和基因表达（Chen等人，2024年）。蚯蚓被广泛认为是土壤健康的关键生物指标，因其对环境污染物的高度敏感性而被广泛用于土壤生态毒性研究（Cheng等人，2021年；Sun等人，2021年）。尽管近期研究主要关注DEHP对蚯蚓的生态影响，但在理解DEHP如何影响全球基因表达模式和代谢物谱方面仍存在较大空白。这一知识空白凸显了需要进一步采用先进分子技术来全面阐明DEHP毒性的分子机制。
Eisenia foetida是经济合作与发展组织（OECD）推荐的标准模式生物，在土壤生态毒性和风险评估研究中得到广泛应用，而M. guillelmi是一种分布在中国北部的典型地下蚯蚓物种。我们的初步研究表明，这两种蚯蚓对DEHP的响应存在显著差异；然而，这些毒性差异的分子机制尚未得到充分探索（Li等人，2023a，2024年）。因此，基于以往研究的局限性和当前的风险评估需求，本研究选用E. foetida（地表生活型）和M. guillelmi（地下生活型）作为实验对象，以研究DEHP的物种特异性毒性。通过结合转录组学和代谢组学分析、病理观察及污染物残留测量，我们旨在阐明DEHP在不同蚯蚓物种中的毒性机制。这些结果为DEHP的陆地生态毒性评估提供了全面的理论基础，这对于准确评估DEHP相关风险和支持土壤健康状况的诊断至关重要。
实验动物和化学物质
本研究选择E. foetida和M. guillelmi作为土壤模型生物，分别代表地表生活型和地下生活型蚯蚓。所有蚯蚓均来自中国江苏省Jurong的一家蚯蚓养殖场。E. foetida和M. guillelmi的平均体重分别为0.36 ± 0.07克和3.05 ± 0.61克，体长分别为61.1 ± 5.6毫米和13.77 ± 7.89毫米。实验前，这些蚯蚓在人工土壤中进行了适应训练。
DEHP暴露对蚯蚓组织的组织病理学影响
本研究首先在两种蚯蚓物种中评估了DEHP在组织层面的毒性作用。暴露21天后，从对照组（CK）和100毫克/千克处理组中随机选取蚯蚓进行石蜡切片处理，随后进行苏木精-伊红染色后的表皮和中肠组织显微镜观察（附录A 图S2）。组织病理学分析显示，在对照组中，E. foetida和M. guillelmi的表皮细胞间质均发生了变化。
DEHP引起的蚯蚓组织损伤及其残留分析
个体死亡或组织损伤通常被认为是生物体层面毒性作用的主要表现。先前的研究表明，尽管DEHP对E. foetida和M. guillelmi>的急性致死风险较低，但在长期暴露条件下仍会引发氧化应激、DNA损伤和细胞膜破坏等不良影响（Li等人，2023a）。在本研究中，我们进一步探讨了DEHP对蚯蚓的健康影响。
结论
本研究采用综合方法（包括组织病理学观察、残留分析、转录组学和代谢组学）全面研究了两种生态位不同的蚯蚓物种E. foetida（地表生活型）和M. guillelmi（地下生活型）的DEHP生态毒性和分子机制。结果表明，DEHP在两种蚯蚓体内均显著积累，并引起了明显的组织损伤，尤其是表皮和中肠组织。
附录A 补充数据
与本文相关的补充数据可在在线版本中找到：xxxxxxxxx。
作者贡献声明
王俊：撰写——初稿、资料收集、概念构思。卢班-宗迪·布达扎波夫：撰写——审稿与编辑、数据分析、概念构思。孔文佳：撰写——审稿与编辑、数据分析、概念构思。姜楠：撰写——审稿与编辑、数据分析、概念构思。景贤月：撰写——审稿与编辑、资料收集、数据分析。高建鹏：撰写——审稿
利益冲突声明
作者声明不存在可能影响本文研究的已知财务利益或个人关系。
致谢
本研究得到了中国国家重点研发计划（项目编号2024YFD1701103）、国家自然科学基金（项目编号42177024、42507053和U2106212）、山东省重点研发计划（项目编号2023CXPT086）以及山东省自然科学基金（项目编号ZR2022QB250）的支持。
