《LWT》：Removing mechanism of ultrasound and slightly acidic electrolyzed water against Listeria monocytogenes biofilms
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针对食品接触面单增李斯特菌生物膜难以清除、威胁食品安全的问题，本研究探讨了超声波与微酸性电解水协同处理的抗菌效能与去除机制。结果发现，超声波-微酸性电解水处理在60秒内即可实现无平板上可培养细胞检出，生物膜清除率达63.40%，并通过多种指标揭示了其协同增效的机理。该研究为食品材料和加工设备的清洗消毒提供了高效的组合策略。
想象一下，您存放在冰箱里的牛奶、蔬菜、肉类，可能在不知不觉中成为了一种致命细菌的“培养皿”。这种细菌就是单增李斯特菌，它不仅能在低温、高盐、低氧的“恶劣”环境中生存，还擅长“抱团”形成生物膜。生物膜就像一个由细菌分泌的、由胞外聚合物构成的坚固“城堡”，将细菌包裹其中，使其能抵抗消毒剂、温度变化和干燥，从而在家庭冰箱和食品加工设备表面顽固地生存数月甚至数年，成为食品安全的持久威胁。传统的消毒方法，如热处理可能破坏食品营养，而常用的化学消毒剂如含氯产品，又可能产生有害物质。那么，有没有一种既高效又安全的解决方案来攻克这个难题呢？
为了回答这个问题，来自河北科技大学食品科学与生物学院的任宏瑞、邵洁瑄、刘少康、李静瑶、郝建雄五位研究人员，在《LWT》期刊上发表了一项研究，系统探究了超声波和微酸性电解水单独及联合使用，对单增李斯特菌生物膜的杀菌效果与去除机制，旨在为食品加工环境的消毒灭菌提供科学依据。他们的研究发现，将这两种技术结合，特别是先进行超声波处理再用微酸性电解水处理，能在极短时间内实现强力灭菌和生物膜清除，展现出了令人瞩目的协同效应。
为开展此项研究，研究人员主要运用了几项关键技术方法。他们使用玻璃载玻片作为载体，培养了5天的成熟单增李斯特菌生物膜。核心的处理技术包括：使用水浴超声波装置在特定参数下对生物膜进行处理；在实验室自制的电解槽中制备特定pH值和有效氯浓度的微酸性电解水；并设定了单一处理、同时处理（SAEW + ultrasound）及两种不同顺序的组合处理（SAEW–ultrasound， ultrasound–SAEW）。评估方法则综合了传统的平板计数、结晶紫染色定量生物膜量，以及一系列细胞生理与表面性质测定，包括MTT法测细胞代谢活性、MATH法测细菌表面疏水性、细菌自聚集能力测定、PI荧光染色测膜渗透性、Zeta电位测定，并最终利用活细胞/死细胞双染色的激光共聚焦显微镜从微观结构上直观验证处理效果。
3.1. 不同处理对单增李斯特菌生物膜去除效果的比较
研究人员首先通过平板计数法比较了不同处理方案。结果显示，单一超声波（US）或单一微酸性电解水处理虽然能减少活菌数，但效果有限。而组合处理显著增强了杀菌效果。其中，超声波-微酸性电解水处理（先超声后SAEW）表现最佳，在30秒内可使活菌数减少2.86 log CFU/mL，而在处理60秒时，平板计数已无法检测到可培养的细菌，杀菌效果显著优于其他组合及单一处理。这表明处理顺序是影响协同效果的关键因素，先利用超声波的物理破坏作用为后续SAEW的化学作用创造有利条件。
3.2. 单增李斯特菌生物膜的染色与观察
为了更全面地评估生物膜清除效果，研究人员采用了结晶紫染色法。结果趋势与平板计数一致，处理时间越长，清除率越高。在所有组合处理中，超声波-微酸性电解水处理在60秒时实现了最高的生物膜清除率，达到63.40%，进一步证实了该组合策略在去除生物膜总量方面的优越性。
3.3. 不同处理对单增李斯特菌生物膜内细菌代谢活性的影响
利用MTT法检测细胞代谢活性发现，无论是超声波还是微酸性电解水处理，随着时间延长，细胞代谢活性均显著下降。其中，微酸性电解水在短时间内（15秒）就表现出较强的抑制作用。而组合处理，特别是超声波-微酸性电解水处理，在60秒时将细胞代谢活性抑制到最低（6.04%），显著低于单一处理。这表明超声波预处理可能“钝化”了生物膜内细胞的代谢系统，使其对后续SAEW的攻击更为敏感。
3.4. 细菌疏水性测定
细菌表面疏水性是影响其黏附和生物膜形成能力的关键因素。研究发现，随着处理时间延长，细菌表面疏水性普遍下降。在所有组合处理中，超声波-微酸性电解水处理导致疏水性降至最低（60秒时为5.67%），表明该处理能最有效地破坏细菌表面的结构蛋白，改变其表面性质，从而削弱其黏附能力。
3.5. 自聚集测定
自聚集是细菌形成生物膜的初始步骤。实验结果显示，单增李斯特菌的自聚集能力随着处理时间的延长而逐渐减弱。同样，超声波-微酸性电解水组合产生了最强的抑制作用，在60秒时将自聚集率从对照组的58.04%降低至44.60%。自聚集行为与生物膜量和疏水性的变化趋势一致，共同表明该组合处理改变了细菌表面的理化性质，削弱了细胞间的相互作用。
3.6. 膜渗透性评估
通过PI荧光探针检测细胞膜通透性发现，处理时间越长，PI荧光强度越高，表明细胞膜损伤越严重。在组合策略中，超声波-微酸性电解水处理组的相对荧光强度最高（60秒时为236.99%），这意味着该处理造成了最严重的膜损伤。这证实了研究人员的推测：超声波处理增加了细菌细胞膜的通透性，使得SAEW能更深入地渗透到细胞内部，加速细胞死亡。
3.7. Zeta电位测定
Zeta电位反映了细菌表面的净电荷分布，与吸附和黏附行为密切相关。研究发现，未经处理的细菌Zeta电位绝对值很高（-113.10 mV）。随着处理进行，其绝对值下降，表明细菌表面电荷发生变化，黏附能力减弱。经过60秒超声波-微酸性电解水处理后，Zeta电位绝对值降至最低（1.25 mV），这可能是由于细菌死亡或从表面脱落所致。该结果与膜渗透性、疏水性等指标相互印证，说明联合处理通过破坏膜完整性和改变表面电荷，共同促进了生物膜的脱附和失活。
3.8. 利用CLSM观察生物膜中细菌存活（活-死）状态
激光共聚焦显微镜的活/死细胞双染色结果提供了最直观的证据。未经处理的5天生物膜呈现出密集的绿色荧光（活细胞）。随着处理时间增加，绿色荧光减少，红色荧光（死细胞）增强。在所有处理中，超声波-微酸性电解水组合处理后，视野中几乎看不到绿色荧光，红色荧光也极少，这表明活细胞几乎被完全清除，残留的死亡细胞也很少，从微观结构上直接验证了该处理卓越的生物膜去除效果。
综合以上研究结果，本研究的结论清晰地指出：在超声波、微酸性电解水及其不同组合策略中，顺序依赖性的“超声波-微酸性电解水”处理（即先超声后SAEW浸泡）展现出最优异的抗菌和生物膜去除性能。该组合能在极短时间内实现强效杀菌和生物膜清除。其协同机制是多方位的：超声波产生的空化效应首先破坏了生物膜结构和细菌细胞膜的完整性，显著增加了膜通透性；这为后续微酸性电解水中的次氯酸等活性成分渗透入细胞内部扫清了障碍，从而能更有效地干扰细胞代谢、导致细胞内容物泄漏，最终引起细胞死亡。同时，该联合处理还显著降低了细菌细胞表面的疏水性、Zeta电位绝对值和自聚集能力，这些表面性质的改变共同削弱了细胞与细胞、细胞与接触面之间的相互作用，使得细菌更容易从生物膜中脱落和被清除。
这项研究的意义在于，它不仅证实了超声波与微酸性电解水联用的高效协同效应，更重要的是明确了“先物理后化学”的处理顺序是实现最佳效果的关键，这为优化食品加工设备和接触面的清洗消毒工艺提供了明确的理论指导。该组合策略兼具高效、快速的特点，且微酸性电解水作为一种近中性、安全性高的消毒剂，避免了传统氯消毒剂可能产生的有害副产物风险，为开发更加安全、环保的食品工业卫生控制方案提供了重要的科学依据。未来，该技术有望在肉类、水产品、果蔬等各类食品的加工环节中得到应用，为保障“从农场到餐桌”的食品安全筑起一道新的技术防线。
