《Immunology》：Blood Immunopathology of Tuberculosis Patients Disrupts Monocyte-Dependent T-Cell Activation and Cytokine Expression
编辑推荐：
本文探讨了结核病（TB）患者血清免疫微环境如何特异性抑制有丝分裂原植物血凝素（PHA）诱导的T细胞反应。研究表明，这种抑制并非直接影响T细胞受体（TCR）或单核细胞固有功能，而是破坏了T细胞与单核细胞之间至关重要的相互作用，特别是影响了CD4+T细胞亚群中CD40L和IL-2的表达。这为理解结核病免疫病理学提供了新的细胞机制视角。
引言：理解结核病的免疫病理
结核病（TB）是由结核分枝杆菌复合群（Mtb）引起的慢性传染病。免疫系统在控制病原体感染中扮演核心角色，大多数感染者可避免进展为活动性疾病，其中T细胞和单核细胞（及其衍生的巨噬细胞）尤为关键。然而，进展为活动性结核病常伴随免疫病理学特征，在肺结核中导致肺组织严重且持久的损伤。慢性炎症变化是其典型表现，血液中的免疫病理变化会影响T细胞功能，与慢性炎症性疾病有高度相似性。其中，评估免疫细胞功能的常用方法是使用有丝分裂原如植物血凝素（PHA）刺激T细胞。PHA是一种植物凝集素，以单核细胞依赖的方式触发T细胞活化和增殖。多项研究证实，结核病患者对PHA的反应减弱甚至缺失，这种损伤在疾病急性期出现，并在抗结核治疗初期有所改善。研究表明，结核病患者血清（或血浆）等非细胞血液成分是导致PHA反应受损的关键因素，但其中具体机制尚不清楚。本研究旨在通过改良体外血清试验，同时分析结核病血清微环境变化对单核细胞和T细胞特异性活化及细胞因子表达的影响，以阐明其具体作用机制。
材料与方法
研究在2023年2月至2024年10月期间，于加纳库马西及阿散蒂地区的五家医院招募了30名结核病患者和28名确诊传染性结核病患者的健康家庭接触者。所有结核病患者均在开始抗结核治疗前入组。研究使用来自同一健康供体的外周血单个核细胞（PBMCs），将其分别与结核病患者或健康接触者的血清样本（在培养基中添加10%）共同培养，并使用三种不同刺激剂：金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB，一种不依赖单核细胞的T细胞刺激剂）、Toll样受体1/2激动剂Pam3CSK4（Pam3，一种不依赖T细胞的单核细胞刺激剂）以及有丝分裂原PHA（一种依赖单核细胞支持的T细胞刺激剂）。细胞培养16小时后，通过多色流式细胞术测定细胞特异性活化标记物（CD25, CD69）和细胞因子（TNF-α, IFN-γ, IL-2, CD40L, IL-6, IL-8）的表达，以比较在不同血清环境下免疫细胞的反应差异。
结果
PHA与SEB诱导T细胞不同的活化与细胞因子表达谱
研究首先比较了不同刺激剂对T细胞活化标记物和细胞因子表达的影响。SEB和PHA均能强烈上调CD4+和CD8+T细胞中CD25和CD69的表达，而Pam3对T细胞活化影响甚微。在细胞因子方面，PHA和SEB均能诱导T细胞表达TNF-α、IFN-γ、IL-2和CD40L，其中SEB的诱导能力更强。细胞因子表达模式分析显示，PHA刺激主要诱导CD4+T细胞产生单一的CD40L，或CD40L与IL-2/TNF-α共表达；而SEB刺激则能诱导产生所有四种细胞因子的CD4+T细胞，且CD40L与其他细胞因子的共表达更为普遍。在CD8+T细胞中，PHA刺激主要产生IL-2、IFN-γ和CD40L单阳性细胞，而SEB刺激则增加了IFN-γ/TNF-α双阳性细胞的比例。这些结果表明，通过测定活化标记物和细胞因子，可以区分SEB和PHA对T细胞的不同刺激模式。
单核细胞细胞因子表达受Pam3、PHA和SEB差异诱导
研究接着分析了单核细胞对三种刺激剂的反应。结果显示，TNF-α、IL-6和IL-8在单核细胞中的表达因刺激剂不同而呈现差异模式。PHA、SEB和Pam3诱导的TNF-α阳性单核细胞比例相似（约4%）。然而，高比例的IL-6阳性单核细胞（>30%）仅由PHA和Pam3诱导，SEB对IL-6表达的影响中等。与TNF-α和IL-6不同，IL-8在无刺激条件下即有显著比例的单核细胞表达，而PHA和Pam3能诱导最高水平的IL-8表达。这些结果表明，细胞内细胞因子测定可以有效评估单核细胞对不同刺激的反应，其中SEB对单核细胞细胞因子表达影响中等，而Pam3和PHA能诱导显著且略有不同的细胞因子模式。
结核病血清特异性抑制PHA诱导的T细胞活化，而非SEB
关键发现在于比较结核病患者与健康接触者血清对免疫反应的影响。结果显示，只有在PHA刺激下，T细胞活化标记物CD25和CD69的表达比例在结核病患者血清存在时显著降低，且CD4+T细胞的降低程度平均高于CD8+T细胞。相反，SEB诱导的CD25/CD69表达在两组血清间无显著差异。进一步分析发现，PHA诱导的CD25/CD69双阳性T细胞比例在结核病血清存在时也显著降低，尤其是在CD4+T细胞中，双阳性细胞不成比例地减少，伴随CD25和CD69单阳性细胞比例增加。这些结果明确显示，结核病血清对PHA特异性T细胞反应具有显著的抑制作用，且尤其影响表达CD25/CD69的CD4+T细胞。
结核病血清介导的抑制作用主要影响PHA诱导的CD4+T细胞中CD40L和IL-2的表达
在细胞因子层面，结核病血清的影响同样具有PHA特异性和T细胞亚群特异性。PHA刺激下，CD40L、IL-2、IFN-γ和TNF-α阳性的CD4+T细胞比例在结核病血清存在时均显著降低，其中CD40L和IL-2的中位降幅最大。CD8+T细胞总体变化较少，仅IL-2阳性细胞比例显著降低。而SEB刺激的CD4+或CD8+T细胞细胞因子表达在两组血清间无显著差异。对细胞因子表达谱的深入分析发现，在结核病血清存在时，仅表达一种或两种细胞因子的T细胞亚群受影响更严重，其比例更低；而表达三种或四种细胞因子的多细胞因子阳性T细胞受影响较小，其中特别是IFN-γ阳性细胞在两组间无差异。这些结果表明，结核病患者血清变化特异性抑制了PHA反应中CD40L/IL-2阳性的CD4+T细胞。
PHA或Pam3激活后的单核细胞细胞因子表达不受结核病血清影响
尽管已知单核细胞表型和功能在结核病期间受血清微环境影响，但本研究未发现结核病血清对单核细胞细胞因子表达的直接影响。PHA诱导的单核细胞TNF-α、IL-6和IL-8表达在两组血清间仅有中度且不显著的差异。同样，无论是能强烈诱导IL-6和IL-8的单核细胞特异性刺激剂Pam3，还是SEB，其诱导的单核细胞细胞因子表达均未受结核病血清影响。这些结果提示，单核细胞功能的改变并非导致结核病中T细胞反应受损的原因，更可能是结核病血清抑制了单核细胞对PHA诱导的T细胞反应所必需的辅助功能。
讨论与结论
本研究的发现表明，结核病血清对免疫反应的抑制作用具有特异性，仅针对PHA诱导的反应。PHA诱导的T细胞活化（特别是CD25/CD69表达）和细胞因子（尤其是CD40L、IL-2和TNF-α）表达在结核病血清存在时显著降低。由于SEB（不依赖单核细胞的T细胞刺激）或Pam3（不依赖T细胞的单核细胞刺激）诱导的T细胞或单核细胞反应均未受结核病血清影响，因此得出结论：结核病患者血清环境的变化损害了PHA诱导的T细胞反应所必需的T细胞与单核细胞之间的相互作用。PHA诱导的单核细胞细胞因子（即TNF-α、IL-6、IL-8）未观察到显著影响，这提示改变的可能是辅助细胞依赖性机制，例如共刺激分子表达、抑制性配体结合或接触依赖性信号传导的变化。
PHA已知可与单核细胞和T细胞上的受体结合，两种结合均可诱导T细胞活化。尽管本研究未发现PHA诱导的单核细胞细胞因子存在差异，但这并不排除结核病血清微环境对单核细胞分泌的其他可溶性因子的影响。此外，结核病血清对单核细胞表型有显著影响，单核细胞受体表达的改变可能是导致PHA刺激期间与T细胞相互作用受损的一个合理解释，这得到了既往基因表达分析结果的支持，该分析发现接触结核病血清后，单核细胞上一大组基因的表达减少。
有趣的是，有证据表明抗原特异性免疫反应也受到结核病血清病理学的影响。PHA反应低的结核病患者对M. tuberculosis蛋白的反应也较弱。类似的关联在类风湿关节炎（RA）等慢性炎症性疾病中也有描述，RA患者受损的PHA反应与高疾病活动度相关，并在成功治疗后恢复正常。结核病血清也能在单核细胞中诱导出典型的慢性炎症过程的细胞因子模式。这些结核病与RA之间的相似性表明，受损的PHA反应背后可能存在相似的机制，并提示炎症变化很可能扮演了重要角色。
本研究存在一些局限性，例如使用血清富集培养基短期孵育参考PBMCs是一种还原论方法，它重现了结核病患者的PHA反应减弱，但未考虑结核病病理中T细胞和单核细胞功能的长期变化。此外，由于单核细胞在培养中表型变化强烈，无法使用经典标记CD14/CD16进行分类，而是用CD11b结合HLA-DR来识别，这也限制了对其亚群的分析。
综上所述，本研究结果支持以下假设：结核病患者血清依赖性PHA反应减弱是单核细胞与T细胞之间相互作用减少的体现。尽管所涉及的确切机制和分子需要进一步阐明，但有充分证据表明这些变化具有免疫病理学意义。因此，新型免疫调节治疗（宿主导向疗法）应考虑将PHA免疫反应作为候选生物标志物，例如用于评估治疗疗效。
