《Nano Today》：Deep tumor penetration of supramolecular Fmoc-Glyco/ Fmoc-diphenylalanine-DOX drug loaded nanorods for targeted chemotherapy
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纳米颗粒形状与表面功能化协同调控可显著增强肿瘤穿透和化疗效果。通过自组装Fmoc-FF模板与Fmoc-单糖（葡萄糖、半乳糖、岩藻糖）及DOX制备不同形貌的纳米载药系统，发现半乳糖修饰的纳米棒（FGal1-2）在体外对HepG2细胞毒性最强，且在3D肿瘤球模型中穿透深度超过80μm，优于纳米球和长纤维结构。体内实验证实该纳米棒具有更高肿瘤蓄积量，85%抑制率且显著降低DOX的心脏毒性。该研究为功能/形貌协同设计的纳米药物载体提供了新策略。
张艳|彭凌欣|叶宝通|卢国栋|李思辰|周静静|米海伊尔·巴尔博尤|陈静华
江南大学生命科学与健康工程学院，中国无锡214122
摘要
纳米颗粒（NPs）在现代癌症化疗中得到了广泛研究，因为它们在靶向药物递送、提高疗效和降低毒性方面具有优势。然而，临床证据仍然表明这些纳米药物的治疗效果有限，这主要是由于药物在肿瘤中的积累不足和组织渗透性差。在本研究中，我们发现对纳米颗粒的形状和表面功能化的协同精确控制可以改善肿瘤渗透性并增强化疗效果。具体来说，由Fmoc-FF支架、肝细胞靶向的Fmoc-单糖和抗肿瘤药物多柔比星（DOX）自组装而成的超分子纳米球/纳米棒，通过对其纳米结构形态和表面生物活性信号的协同控制实现了这一效果。这些pH敏感的自组装纳米颗粒能够控制纳米结构的形状和多价碳水化合物功能化表面，从而在酸性肿瘤微环境中激活并触发药物释放。体外实验表明，长度约为250纳米、直径为25纳米的半乳糖修饰纳米棒FGal1–2对HepG2细胞的毒性最高，并显著增强了细胞摄取。此外，在3D肿瘤球体模型中，纳米棒FGal1–2的渗透深度超过80微米，优于纳米球FGal1–1和更长的纳米棒FGal1–3。进一步的体内动物研究显示，与相应的纳米球相比，纳米棒FGal1–2在肿瘤中的积累更多，肿瘤抑制作用最强，多柔比星的毒性显著降低，肿瘤体积减少了85%。这项工作为设计具有功能性/形态效应的纳米颗粒以用于先进的抗肿瘤药物递送提供了新的见解。
引言
在过去几十年中，癌症化疗取得了快速发展，但目前的临床数据仅显示出有限的治疗效果，部分原因是药物在肿瘤中的积累和渗透不足[1]，[2]。在这方面，脂质体、金纳米颗粒和聚合物胶束已成为将治疗剂靶向递送到肿瘤的可行方法，同时具有较长的循环时间和较低的毒性[3]，[4]。纳米颗粒（NPs）的肿瘤靶向效应可以来源于尺寸决定的增强渗透性和滞留效应（EPR），或者基于生物识别的主动靶向生物活性抗体[5]，[6]、肽[7]，[8]、寡核苷酸适配体[9]，[10]和小分子[11]。然而，有报告指出，平均只有0.7%的注射纳米颗粒能够到达肿瘤[12]。即使对于已经聚集在实体肿瘤周围的载药纳米颗粒，进一步渗透到深层肿瘤组织仍然具有挑战性，导致治疗效果不佳。
除了增强纳米颗粒肿瘤渗透性的策略，如酶触发激活和重塑肿瘤微环境[13]，[14]，[15]，纳米颗粒的固有物理性质，特别是它们的大小和形状，被认为是成功实现靶向药物递送和肿瘤内分布的关键决定因素[16]，[17]，[18]。通常，较小的纳米颗粒比大的纳米颗粒能更深入地渗透肿瘤，但会迅速清除且滞留性较差[19]，[20]。同时，100–200纳米范围内的纳米颗粒通常在肿瘤部位有良好的积累[21]。此外，由于不同的血液动力学和较大的细胞表面相互作用面积，纳米棒通常比纳米球表现出更好的细胞内化和更深的肿瘤组织渗透[22]，[23]，[24]。然而，过长且纵横比（AR）过高的纳米棒往往渗透性降低[25]。因此，已经开发出尺寸转换策略用于智能纳米医学，其中较大的纳米颗粒在细胞摄取后转变为较小的或棒状形态，从而增加肿瘤渗透深度[26]，[27]。然而，这些发现高度依赖于纳米颗粒的组成和肿瘤类型。除了最常研究的纳米颗粒，如金纳米颗粒[28]，[29]、PEG-PLA共聚物[30]和纳米二氧化硅[31]，由简单有机成分自组装的超分子纳米颗粒的影响尚未得到充分研究。
N-氟苯甲酰甲基苯丙氨酸（Fmoc-FF）作为一种能够进行超分子自组装的简单肽，已被广泛用于构建各种水凝胶材料[32]，[33]。通过疏水相互作用和β-折叠片层堆叠，基于Fmoc-FF的生物材料在伤口敷料、药物递送、细胞培养、生物传感等领域得到了广泛应用，尤其是在水凝胶形式中[34]，[35]，[36]。我们之前报道了一种基于Fmoc-FF支架的新型共组装纳米颗粒，具有可调的形状和大小[37]，[38]。在由Fmoc-FF和Fmoc-单糖共组装的球形、棒状和纤维状纳米颗粒中，长纳米纤维显示出更好的天然肝素功能模拟能力。此外，超分子聚合过程提供了增强的多价效应[39]，[40]，[41]，[42]，从而在加入锚定糖基团后提高了靶向效率。这些结果促使我们进一步探索这些纳米结构作为抗肿瘤药物多柔比星（DOX）的靶向递送载体。
在本研究中，将Fmoc功能化的碳水化合物靶向成分和疏水性抗肿瘤药物DOX共组装到Fmoc-FF模板中（图1），该模板可以形成从纳米球到不同纵横比的纳米棒的各种形状的功能性纳米药物。葡萄糖、半乳糖和岩藻糖被用作碳水化合物靶向基团[43]，[44]，而半乳糖已知对肝细胞具有额外的亲和力[45]，[46]。此外，抗肿瘤药物DOX通过氢键、π-π堆叠和疏水相互作用被结合到纳米组装结构中。这里描述的前所未有的超分子设计的一个优势是能够精确协同控制纳米颗粒的形状和表面糖配体的多价呈现，从而实现强烈的体内靶向亲和力。因此，可以使用体外 3D肿瘤球体模型和体内携带肿瘤的小鼠模型来评估载药纳米球/纳米棒的治疗效果，探讨自组装Fmoc-FF支架的纳米载体形状对肿瘤渗透、生物分布和抗肿瘤性能的影响。
部分片段
共组装纳米球/纳米棒的制备
这里描述的自组装超分子纳米颗粒由三个主要成分组成：用于自组装的Fmoc-FF核心模板[32]，[47]、用于细胞靶向的Fmoc-碳水化合物基成分，以及用于肿瘤治疗的疏水性药物DOX。9-氟苯甲基化单糖（Fmoc-Glu、Fmoc-Gal和Fmoc-Fuc）按照先前报道的方法合成[37]，[38]，产品结构通过1H NMR进行了确认。
结论
总之，我们在这里证明了形状依赖的靶向和功能配体呈现的协同整合能够实现深度肿瘤药物渗透。通过超分子自组装，可以轻松生成各种形状和大小的载药纳米载体，这些纳米载体由一系列简单的合成Fmoc修饰单糖（Fmoc-Glu、Fmoc-Gal和Fmoc-Fuc）组成，并将其整合到Fmoc-FF支架中进一步与多柔比星-DOX共组装。通过调整进料条件
材料
Fmoc-FF由GuoTai生物技术有限公司提供。β-D-葡萄糖戊酸酯、岩藻糖、β-D-半乳糖戊酸酯和9-氟苯甲醇从Energy Chemical购买。4-二甲基氨基吡啶（DMAP）和硼 trifluoride diethyl etherate（BF3·Et2O，46.5%）从Aladdin购买。二氯甲烷（DCM）、二甲基亚砜（DMSO）、甲醇、乙腈、氯仿、吡啶和甲醇钠从Sinopharm化学试剂有限公司购买。
CRediT作者贡献声明
张艳：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，验证，监督，方法学，研究，数据管理，概念化。彭凌欣：方法学，研究，数据管理。叶宝通：方法学，研究，数据管理。卢国栋：研究，数据管理。李思辰：方法学，形式分析，数据管理。周静静：研究，形式分析。米海伊尔·巴尔博尤：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本工作得到了国家重点研发计划 [2021YFC2103100]、国家自然科学基金 [22008090]、江苏省自然科学基金 [BK20180625]以及江苏省优秀博士后人才资助计划的支持。
