《NanoImpact》：Toxicity of polycaprolactone nanoplastics, pristine or weathered in environmental conditions, to human intestinal epithelial cells, in vitro
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研究评估聚己内酯（PCL）纳米塑料（NPLs）在 pristine 状态及加速老化后的毒性，采用携带野生型及 1007fs 突变 NOD2 的 Caco-2 细胞与 HT29-MTX 细胞共培养模型，检测细胞毒性、遗传毒性、炎症反应及肠道屏障完整性，发现无论老化与否或颗粒尺寸，PCL NPLs 均未显示显著毒性。
M. Boulée | V. Bard | M. Papin | D. Béal | S. Devineau | D. Fenel | E. Dusacq | V. Collin-Faure | T. Rabilloud | T. Douki | M. Carriere
格勒诺布尔阿尔卑斯大学、法国原子能委员会（CEA）、法国国家科学研究中心（CNRS）、格勒诺布尔高等工业学院（INP）、IRIG、SYMMES，法国格勒诺布尔38000
摘要
塑料几乎被用于所有日常产品中，是主要的污染源，尤其是以微塑料和纳米塑料（MNPs）的形式。微塑料和纳米塑料对健康的影响，尤其是对消化道的影响，目前仍知之甚少，尤其是在患有炎症性肠病等脆弱人群中。本研究的目的是评估一种可生物降解聚合物——聚己内酯（PCL）的纳米塑料（NPLs）的体外毒性，包括其原始状态以及在环境条件下加速老化后的毒性。后者会导致潜在有毒的PCL寡聚物的释放。为此，我们使用了克罗恩病（CD）遗传易感性的体外模型，该模型由HT29-MTX细胞与经过基因改造的Caco-2细胞共培养而成，Caco-2细胞表达了野生型（WT）或突变的核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）（分别代表健康个体Caco-2 NOD2WT和易感个体Caco-2 NOD21007fs）。我们研究了PCL NPLs在老化过程中的物理化学变化。细胞暴露于原始状态和老化状态的PCL NPLs后，对其细胞毒性、基因毒性、炎症潜力、对细胞氧化还原平衡的影响以及上皮屏障的完整性进行了评估。结果表明，加速老化会增加PCL NPLs的结晶度并导致其融合。PCL NPLs在细胞内积累并降解，释放出一些PCL寡聚物。然而，在测试条件下，无论是原始状态还是老化状态的PCL颗粒，在两种细胞系统中均未表现出明显的毒性，无论颗粒大小或老化程度如何。这些数据证实，无论是完整的还是部分溶解的PCL NPLs，在Caco-2 / HT29-MTX细胞急性短期暴露下，仅表现出轻微的毒性。
引言
塑料是一种重要的材料，由于其优越的性能和低成本而被广泛应用于许多领域（Andrady和Neal，2009年）。2022年，塑料的产量超过了4亿吨，由于废物管理不善，造成了严重的环境污染，仅有10%的塑料被回收利用（Geyer等人，2017年；Lau等人，2020年）。据估计，每年有480万至1270万吨塑料垃圾进入海洋（Jambeck等人，2015年）。塑料的抗自然降解性加剧了这一问题，导致其在环境中积累并持续存在数十年甚至数百年。一旦进入环境，塑料垃圾会经历光化学、机械、水解、热和生物作用，从而形成微塑料和纳米塑料（MNPs）（Zhang等人，2021a）。微塑料（MPs）指的是小于5毫米的颗粒，而纳米塑料（NPLs）通常定义为小于1微米的颗粒，尽管不同研究中的尺寸定义有所不同（欧洲食品安全局食品链污染物小组（CONTAM），2016年；Hartmann等人，2019年）。
人类主要通过摄入或吸入途径接触微塑料和纳米塑料（MNPs）（Galloway，2015年）。在饮用水和各种食品中广泛检测到了MNPs的存在，包括海产品、盐、鱼类、甲壳类动物以及糖、蜂蜜和啤酒（Schymanski等人，2018年；Toussaint等人，2019年；Kosuth等人，2018年）。由于MNPs的多样性和饮食习惯的差异，评估人类暴露情况仍然具有挑战性。然而，Senatirajah等人的一项研究估计，人们每周摄入的MNPs量在0.1至5克之间（Senathirajah等人，2021a），尽管这一估计可能偏高。虽然大部分MNPs会通过粪便排出（Ma等人，2021年；Schwabl等人，2019年；Yan等人，2022年；Zhang等人，2021b），但有些MNPs能够穿越生物屏障进入血液，并且最近在多个人体器官中被发现（Li等人，2024年）。目前，MNPs的健康影响仍不完全清楚，尤其是对消化道的影响。在脊椎动物和无脊椎动物中，摄入MNPs与肠道屏障功能障碍、炎症和菌群失调有关，这些症状类似于炎症性肠病（IBD）的表现。在斑马鱼中，暴露于聚丙烯（PP）和聚苯乙烯（PS）纳米塑料会导致黏膜损伤、肠道通透性增加、菌群失调和炎症（Qiao等人，2019年）。在小鼠中，PS纳米塑料也会在肠道组织中积累，破坏肠道屏障并引发肠道和肝脏的不良影响，如氧化应激、炎症和代谢紊乱，其中一些影响是由微生物群失调引起的（Deng等人，2017年；Jin等人，2019年；Lin等人，2024年）。大多数关于MNPs毒性的体外研究使用的是PS颗粒，结果显示在极高浓度下才具有毒性，而且这些颗粒会在肠道细胞内大量积累（Jones等人，2023年）。
微塑料和纳米塑料对脆弱人群的影响，特别是患有炎症性肠病（CD）的人群，目前仍缺乏研究。尽管CD的确切原因尚不清楚，但遗传因素、环境因素和免疫系统功能障碍的结合被认为在其发病和加重中起作用，导致肠道屏障功能障碍和异常的免疫反应（Torres等人，2017年）。Yan等人发现，IBD患者粪便中MNPs的存在与疾病严重程度呈正相关（Yan等人，2022年）。此外，与健康小鼠相比，暴露于PS纳米塑料会加重DSS诱导的结肠炎症状（Luo等人，2022年；Zheng等人，2021年）。
鉴于不可生物降解塑料对健康和环境的不良影响，开发可生物降解塑料被认为是一个有吸引力的替代方案，因为它们在环境中的半衰期较短，从而降低暴露风险（Napper和Thompson，2019年）。其中，聚己内酯（PCL）作为一种有前景的可生物降解聚酯脱颖而出，因为它能够在微生物作用或化学水解下快速分解（Ntrivala等人，2025年）。PCL的应用正在扩大，特别是在医疗和生物医学领域（例如可吸收设备和药物输送系统），同时也用于食品包装、粘合剂、农业、3D打印和涂层等方面（详见Ntrivala等人，2025年）。尽管FDA认为PCL无毒，但其体内长期降解可能会释放寡聚物，从而引发潜在的毒性效应，因为一些研究表明PCL纳米塑料和寡聚物会干扰上皮细胞和免疫细胞的正常功能（Collin-Faure等人，2025年；Jesus等人，2020年；Singh和Ramarao，2013年）。这种MNPs和寡聚物的组合可能是导致CD发病或加重的环境因素之一，尽管相关毒性已被关注，但至今仍被忽视（Sukhanova等人，2018年；Waldman和Rillig，2020年）。
本研究旨在评估原始状态或与环境条件接触后降解产生的PCL纳米塑料的毒理学影响，重点关注亚微米级别的颗粒。我们之前已经研究了人工老化过程中PCL NPLs的寡聚物释放情况（Boulée等人，2025年；Douki等人，2024年），发现随着PCL的水解，产生了从单体到六聚体的各种寡聚物（Boulée等人，2025年；Douki等人，2024年）。因此，本研究的首要目标是确定颗粒物理化学性质的变化（包括寡聚物的释放）是否会导致其毒性。其次，本研究旨在评估它们对肠道的影响，通过代表健康个体和具有CD遗传易感性的体外人类肠道上皮模型进行评估。传统的IBD毒理学研究使用的体外模型是通过让Caco-2细胞暴露于强烈的炎症刺激来模拟疾病的活跃阶段的（Leonard等人，2010年）。在这里，我们使用了克罗恩病遗传易感性的体外模型，即经过基因改造的Caco-2细胞，表达野生型或突变的核苷酸结合寡聚化结构域2（NOD2）。NOD2在上皮细胞对微生物群和病原体的反应中起关键作用，它可以检测细菌细胞壁中的胞壁二肽（MDP），从而触发NF-κB信号通路和随后的炎症反应（Girardin等人，2003年）。NOD2基因与CD有关，已鉴定出60多种变异，30%的CD患者携带NOD2突变。与CD最密切相关的突变是1007fs突变（NOD21007fs）（Economou等人，2004年；Schnitzler等人，2014年），这种突变会导致蛋白质截短，无法识别MDP，从而破坏NF-κB信号通路（Inohara等人，2003年）。这样的细胞模型代表了易患CD的风险人群。Caco-2 NOD2WT和Caco-2 NOD21007fs细胞与分泌黏液的HT29-MTX肠道细胞共培养，以模拟分泌黏液的回肠上皮（Lesuffleur等人，1990a；Dorier等人，2019年）。在评估了老化对PCL NPLs物理化学性质的影响后，还评估了原始状态和老化状态的PCL NPLs在细胞内的积累情况、对细胞活力、上皮屏障完整性、细胞内ROS水平、DNA完整性和炎症反应的影响。本研究提供了有关可生物降解的MNPs（即PCL NPLs及其降解产物）对易患CD人群的肠道上皮细胞的毒理学影响的宝贵数据。
章节片段
PCL颗粒
PCL纳米塑料（直径为100纳米、200纳米、500纳米或1000纳米）从Phosphorex（美国霍普金顿）购买，以水悬浮液的形式储存，并保存在4摄氏度下。这些颗粒用于持续药物输送。本文报告的所有物理化学表征和毒性测试均使用这些未标记的PCL颗粒进行。对于通过共聚焦荧光显微镜评估的细胞摄取实验，PCL纳米塑料用Disperse Blue 14（DB14）进行了标记。
人工老化和物理化学表征
根据制造商的信息，PCL颗粒的直径分别为100纳米、200纳米、500纳米和1000纳米。透射电子显微镜（TEM）分析显示这些颗粒呈球形，但尺寸分布相当不均匀。测得的平均直径分别为78±22纳米、204±87纳米、505±182纳米和939±275纳米（图1A-D）。
这些观察结果通过动态光散射（DLS）分析得到了验证，结果显示100纳米和200纳米颗粒的平均Z值分别为105±5纳米和197±2纳米。
讨论
像PCL这样的可生物降解塑料因其优越的性能和低成本而被开发出来，应用于包装、3D打印和医疗领域（Woodruff和Hutmacher，2010年）。尽管PCL已获得FDA的生物相容性批准，但其在体内的缓慢降解引发了人们对可能释放的MNPs和寡聚物的担忧，这些物质可能影响健康。一些研究表明PCL具有细胞毒性和/或会干扰免疫细胞的功能。
结论
本研究在模拟环境暴露条件的情况下，评估了PCL纳米塑料对人类结肠上皮模型的毒性效应。结果表明，老化改变了颗粒的物理化学性质，导致结晶度增加和寡聚物的释放。无论颗粒大小或是否老化，原始状态和老化状态的PCL纳米塑料在评估的暴露条件下均未引发任何毒性。
CRediT作者贡献声明
M. Boulée：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，可视化，研究，形式分析。V. Bard：可视化，研究，形式分析。M. Papin：可视化，研究，形式分析。D. Béal：研究，形式分析。S. Devineau：研究。D. Fenel：研究。E. Dusacq：研究。V. Collin-Faure：研究，形式分析。T. Rabilloud：研究。T. Douki：撰写 – 审稿与编辑，可视化，验证。
资助
本工作是在PLASTOX项目框架下进行的，该项目获得了法国国家研究署（ANR，PLASTOX资助号：ANR-21-34–0028CE-02）、法国国家环境与卫生安全署（ANSES，EXMINA资助号：PNR EST-21-077）以及欧盟“地平线2020”研究与创新计划（资助协议号：965196，项目名称：PLASTICHEAL）的资助。该项目还得到了法国政府通过France 2030投资计划的财政支持。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
本项目得到了CEA流式细胞术设施的帮助，该设施由格勒诺布尔阿尔卑斯大学化学、生物学与健康研究生院（GRAL）资助（ANR-17-EURE-0003）。研究还使用了格勒诺布尔Instruct-ERIC中心（ISBG；UAR 3518 CNRS CEA-UGA-EMBL）的电子显微镜设施，该设施得到了法国综合结构生物学基础设施（FRISBI；ANR-10-INSB-05-02）和格勒诺布尔阿尔卑斯大学研究生院项目（Ecoles）的资助。
