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1. 研究发现脑震荡（TBI）后雌雄小鼠在神经炎症、血管及行为恢复中存在显著性别差异，且雌鼠不同雌激素周期阶段（proestrus/estrus/metestrus/diestrus）的免疫反应和脑血流调控存在周期依赖性差异，但行为改善与性别和周期关联较弱。
塔比莎·罗亚尔|潘卡杰·K·阿卢瓦利亚|玛尤里·古尔哈内|埃维拉·萨莱斯|潘卡杰·高尔|米纳克希·阿卢瓦利亚|塔杰曼·兰达瓦|什雷娅·苏尼尔|斯里拉姆·布迪姆|卡迪贾·阿克特|穆罕默德·B·汗|桑图·戈什|巴巴克·巴巴恩|大卫·C·赫斯|费尔南多·L·瓦莱|克里希南·M·丹达帕尼|拉文德拉·科尔赫|库马尔·瓦伊巴夫
乔治亚大学奥古斯塔医学院神经外科系，奥古斯塔，乔治亚州
摘要
创伤性脑损伤（TBI）会引发复杂的神经炎症级联反应，这些反应显著影响恢复结果。尽管此前已有关于神经炎症性别差异的报道，但由于尚未充分了解雌性发情周期在损伤后反应中的作用，因此研究结果仍不明确。在这项研究中，我们旨在探讨TBI后神经炎症、血管和行为结果的性别差异，特别关注雌性小鼠发情周期的不同阶段。雄性和雌性小鼠均接受了可控皮质撞击（CCI）处理，随后对其行为缺陷、脑血流量（CBF）、免疫细胞浸润和炎症基因表达进行了评估。虽然TBI在两性中均引发了强烈的神经炎症和CBF下降，但雌性小鼠表现出髓系细胞、小胶质细胞和T细胞数量显著增加，以及关键炎症因子（Btk、Inpp5d和Tmem173）表达升高，而Grm2表达则下调。根据发情周期的不同阶段（发情前期、发情期、发情后期和绝经期）对雌性小鼠进行分组后发现，Inpp5d、Csf3r、Csf1r、CD84、Tmem173、Homer1、Grm2和Supt7l的表达发生了变化。值得注意的是，受伤的雌性小鼠在某些参数上表现出不同的改善，尽管撞击时的发情周期阶段对CBF的影响有限但具有阶段性差异。与雄性或不同发情阶段的雌性小鼠相比，雌性小鼠在行为测试中未显示出显著差异。然而，雌性小鼠在开放空间中更频繁地前往中心区域。这些发现突显了TBI对神经炎症和转录反应的性别特异性，并表明发情周期对此有适度调节作用。我们的研究进一步表明，在细胞和分子水平上，某个发情阶段可能比其他阶段更容易发生神经炎症或神经血管损伤。然而，在包含随机周期雌性群体的研究中，这种差异可能会被掩盖。因此，我们的结果强调了在针对TBI和其他脑疾病的性别相关研究中纳入性别、发情周期和激素状态的重要性，以指导针对性治疗策略的开发。
引言
创伤性脑损伤（TBI）是一种由外部力量作用于头部导致的复杂且改变生活的疾病，会破坏正常的脑功能。根据严重程度，TBI可以从轻微的脑震荡到严重的穿透性损伤，后者可能导致长期残疾或死亡。跌倒和路边事故是全球TBI的主要原因，在某些地区，冲突和恐怖主义也是重要诱因（Guan等人，2023年）。2019年报告的新病例数为2716万例（Guan等人，2023年），TBI给个人和医疗系统带来了巨大的经济负担，临床恢复通常需要大量的医疗护理和康复，平均每例费用数千美元（Peterson等人，2024年）。其后果远不止限于直接的神经损伤，TBI还会增加精神疾病（Halabi等人，2024年12月12日）、神经退行性疾病（如阿尔茨海默病，Xu等人，2024年）和多发性硬化症（Johansson等人，2024年6月1日）的风险，以及心血管疾病和糖尿病等系统健康问题（Halabi等人，2024年12月12日）。生物学和人口统计因素（如性别、年龄和损伤严重程度）显著影响TBI的结果（Blaya等人，2022年3月1日；Gupte等人，2019年10月23日；Xu等人，2024年）。
许多神经性疾病、感染性和非感染性疾病中都存在性别差异（Caplan等人，2017年；Chamekh和Casimir，2023年；Rahimian等人，2019年）。神经炎症是TBI和其他脑损伤后继发性损伤的关键机制，对长期结果有显著影响（Zhao等人，2023年6月23日）。这一过程涉及驻留的小胶质细胞、星形胶质细胞和浸润的免疫细胞的激活，导致损伤部位出现促炎环境。虽然急性炎症有助于清除细胞碎片和修复（Jarrahi等人，2020年；MV和DB，2016年8月19日），但其长期激活会加剧神经功能障碍并导致进行性神经退行性变（EA等人，2020年11月）。关于脑损伤后的炎症机制，已有更多研究集中在男性身上，因此缺乏基于性别的准确评估。先前使用混合性别小鼠群体的研究展示了TBI病理和神经炎症的总体情况（Ahluwalia等人，2023年1月7日；Vaibhav等人，2020年5月29日；Vaibhav等人，2024年5月11日）。此外，孕酮和雌激素被认为通过减少促炎细胞因子（如IL-1β和TNF-α）并促进支持恢复的神经生长因子来减轻炎症（Ma等人，2019年10月4日；Y等人，2024年8月）。此外，发情周期中的孕酮升高与TBI后的脑损伤减少有关（J等人，2019年3月20日；Ma等人，2019年10月4日）。雌激素和孕酮还调节外周免疫细胞（Fairweather等人，2024年9月17日；JA等人，2020年10月27日；LM等人，2022年9月1日）和胶质细胞的激活（E等人，2024年10月18日；J等人，2021年3月；JA和LM，2021年6月）。然而，已有研究表明，损伤后的性别差异在细胞和空间反应上存在显著差异。Villapol等人报告称，TBI后7天，雄性小鼠的星形胶质细胞反应比雌性小鼠更快更强烈（Villapol等人，2017年）。同样，最近在大鼠CCI模型中的研究未观察到性别在病理和神经炎症方面的差异，除了血脑屏障通透性方面（Scott等人，2022年）。此外，遗传因素和性激素的保护作用与不利影响之间的冲突体现在绝经前和绝经后女性在TBI后的不同结果上（Blaya等人，2022年3月1日；ZJ等人，2022年4月）。此外，女性更容易患神经炎症和自身免疫性疾病，如多发性硬化症（Walton等人，2020年11月11日）和狼疮（Fairweather等人，2024年9月17日）。过去几年的全基因组关联分析（GWAS）发现了男性和女性之间的炎症差异（Huang等人，2021年8月12日；Marttila等人，2013年6月11日；Zeng等人，2018年8月3日），这些差异可能加剧慢性炎症并增加长期神经损伤的风险。因此，显然TBI和其他脑疾病中存在性别差异，但由于缺乏确证性报告，这些因素的真实程度无法完全确定（Caplan等人，2017年；Chamekh和Casimir，2023年；Clayton和Collins，2014年；Rahimian等人，2019年）。因此，需要进一步的研究。在本研究中，我们评估了雄性和雌性小鼠受损大脑中的炎症反应和免疫细胞浸润的差异，并通过根据发情周期对雌性小鼠进行分组，进一步研究了血管和行为结果。
动物
本研究遵循《实验室动物护理和使用指南》（NIH出版物编号85–23）进行，并获得了奥古斯塔大学动物使用研究与教育委员会的批准（编号2021–1046和2017–0838）。雄性和雌性C57Bl/6J小鼠（18-23周龄）在12小时光照/12小时黑暗周期下饲养，温度为23±1°C。食物和水可以随意提供。
可控皮质撞击
小鼠使用异氟醚（2%）麻醉，然后分别接受假损伤或可控损伤
TBI导致外周免疫细胞浸润和驻留免疫细胞上调
TBI导致顶叶大脑形成空洞、炎症、坏死和组织损失（补充图5）。假损伤和TBI的大脑冠状切片进一步分析了炎症细胞，并用外周血细胞标记物CD45和髓系免疫细胞标记物CD11b进行染色。TBI大脑显示出CD11b和CD45的表达升高（图1；p<0.01），表明外周免疫细胞发生了浸润。此外，通过免疫标记进一步评估了大脑区域细胞的炎症状态
讨论
TBI导致急性损伤，从而分泌与损伤相关的分子模式（DAMPs）、细胞因子和趋化因子，这些物质随后会引发并加剧受损大脑中的免疫激活和神经炎症（Braun等人，2017b；Braun等人，2017c；Goldman等人，2022年）。这些DAMPs、细胞因子和趋化因子不仅有助于招募外周细胞进入受损大脑，还使驻留的免疫细胞在损伤后发生极化（Braun等人，
结论
我们的研究探讨了性别、发情阶段和TBI结果之间的相互作用。总之，我们的结果显示TBI后免疫细胞激活存在性别差异，导致CBF和行为结果相似。我们的数据表明，雌性小鼠的免疫细胞激活趋势发生了改变，并在行为结果上表现出一些改善。有趣的是，不同发情阶段的雌性小鼠结果有所不同
CRediT作者贡献声明
克里希南·丹达帕尼：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。潘卡杰·高尔：撰写 – 审稿与编辑，正式分析。费尔南多·瓦莱：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿。埃维拉·萨莱斯：撰写 – 审稿与编辑，研究，正式分析。库马尔·瓦伊巴夫：撰写 – 审稿与编辑，撰写 – 原稿，监督，方法学，研究，概念化。塔杰曼·兰达瓦：撰写 – 审稿与编辑，正式分析，概念化。拉文德拉
未引用参考文献
Blaya等人，2022年；E等人，2024年；J等人，2021年；J等人，2019年；JA等人，2020年；JA和LM，2021年；Johansson等人，2024年；Konovalov等人，2023年；LM等人，2022年；Ma等人，2019年；Marttila等人，2013年；MV和DB，2016年；Procedure，U.A.C.C.S.O.，2023年；Vaibhav等人，2020年；W等人，2019年；Y等人，2024年；Zeng等人，2018年。
利益冲突
作者声明本研究在没有任何可能被视为潜在利益冲突的商业或财务关系的情况下进行。
资金声明
本项目的资金由奥古斯塔大学研究所提供的奖项支持（MCGFD08343和RIA00056）给KV。
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的竞争性财务利益或个人关系可能影响本文所述的工作。
致谢
我们感谢AU的电子显微镜与组织学以及流式细胞术核心设施（RRID: SCR_026810和025747）对本研究的支持。同时感谢神经外科系的Shannon Derthick女士提供的图表和艺术设计。
