《Journal of Cellular and Molecular Medicine》：Jianpi Jiedu Xiaozheng Fang Regulates Hepatocellular Carcinoma Proliferation and Metastasis Based on Network Pharmacology
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本研究结合网络药理学、生物信息学及多层面实验（细胞、类器官、动物），系统揭示了中药复方健脾解毒消癥方（JPJDXZF）通过调控Hippo信号通路核心效应子YAP/TAZ的活性，进而下调下游关键靶基因BIRC5（Survivin）的表达，从而抑制肝细胞癌（HCC）细胞增殖、迁移并促进其凋亡的作用机制，为JPJDXZF的临床应用提供了实验依据。
引言
肝细胞癌（Hepatocellular Carcinoma, HCC）是一种高发病率与死亡率的原发性肝脏恶性肿瘤，其五年生存率低，治疗选择有限，构成重大的全球健康负担。其发生发展与遗传、环境及行为因素（如肝硬化、酒精性肝病、糖尿病、肥胖）等多种因素相关。尽管手术切除和肝移植是主要根治手段，但基于肿瘤负荷的分期系统难以完全应对HCC显著的生物学异质性。因此，阐明HCC进展的分子机制并探寻新的治疗策略具有迫切的临床需求。
传统中医药（Traditional Chinese Medicine, TCM）基于长期的临床实践，以其多成分、多靶点、多通路的特点，在癌症治疗中展现出低毒性和整体调节的优势。基于“益气健脾”和“解毒化瘀”治则的方剂在HCC管理中显示出疗效。临床实践表明，健脾解毒消癥方（Jianpi Jiedu Xiaozheng Fang, JPJDXZF）在治疗晚期或巨块型HCC患者中表现出良好的治疗效果，但其抗肿瘤作用的分子机制尚未被系统阐明。网络药理学（network pharmacology, NP）为系统性阐释TCM复方中活性成分、分子靶点与疾病通路间的相互作用提供了有效策略。Hippo信号通路的失调与HCC进展密切相关，其核心下游效应子YAP和TAZ通过激活TEAD依赖性转录程序促进肿瘤生长。研究显示，YAP/TAZ信号激活可上调抗凋亡基因BIRC5（Survivin）的表达，而抑制YAP/TAZ活性则降低BIRC5表达，提示了YAP/TAZ-BIRC5调控轴在癌症中的功能。
材料与方法
本研究通过SymMap、TCMID、TCMSP和TCM-ID数据库筛选JPJDXZF的活性成分，经ADME参数（DL≥0.18）筛选后，利用SwissTargetPrediction数据库预测药物靶点，并使用Cytoscape构建“JPJDXZF-活性成分-靶点”网络。从TCGA和GTEx数据库获取HCC临床与转录组数据，鉴定差异表达基因（Differentially Expressed Genes, DEGs）。利用GEO数据库中的HCC芯片数据集GSE138178作为外部验证集，并通过加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis, WGCNA）筛选关键模块与枢纽基因。通过Venn图分析，对HCC预后相关基因、JPJDXZF靶基因、GSE138178差异基因及WGCNA枢纽基因取交集，鉴定核心靶点。对核心靶点进行KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）通路富集分析。
JPJDXZF由党参、茯苓、白术、山药、莪术、土鳖虫、桃仁、鳖甲、青蒿、山慈菇、半枝莲、夏枯草、甘草、白花蛇舌草等十四味药材组成。通过灌胃SD大鼠制备JPJDXZF含药血清。在细胞水平，使用人HCC细胞系HepG2和MHCC97-H，通过CCK-8（Cell Counting Kit 8）检测细胞活力、流式细胞术检测细胞凋亡、Transwell和小室划痕实验检测细胞迁移能力。在类器官水平，从HCC患者新鲜肿瘤组织培养患者来源类器官（patient-derived organoids），观察JPJDXZF含药血清对类器官生长直径、ATP活性及增殖标志物Ki67表达的影响。在动物水平，建立HepG2细胞皮下移植瘤裸鼠模型，灌胃给予JPJDXZF，评估其对肿瘤体积、重量的影响。通过qRT-PCR（quantitative real-time PCR）和Western blot检测BIRC5、YAP、TAZ等基因的mRNA和蛋白表达水平。通过siRNA干扰MST1/2、过表达BIRC5、以及使用Hippo通路调节剂EMT inhibitor-1进行功能回复实验，验证JPJDXZF通过Hippo-YAP/TAZ-BIRC5轴发挥作用的机制。通过核质分离、TEAD荧光素酶报告基因实验评估YAP/TAZ的核转位及转录活性。通过免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）和苏木精-伊红（haematoxylin–eosin, H&E）染色进行组织病理学分析。
结果
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核心靶点鉴定与通路富集：网络药理学分析鉴定出JPJDXZF的1443个活性成分及435个相应靶点。通过分析TCGA/GTEx数据，得到18个与HCC预后相关的JPJDXZF靶向差异基因。结合GEO数据集GSE138178的差异基因及WGCNA分析得到的枢纽基因，Venn图交集分析成功鉴定出BIRC5和CYP2E1作为JPJDXZF治疗HCC的两个潜在核心靶点。生存分析显示，BIRC5高表达与HCC患者不良预后显著相关，其受试者工作特征（received operating characteristic, ROC）曲线下面积（Area Under Curve, AUC）达0.936，显示出良好的诊断价值。KEGG通路富集分析表明，JPJDXZF的核心靶点主要富集于Hippo信号通路、凋亡、药物代谢等多个通路，其中BIRC5被确定为Hippo通路的下游调控基因。
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JPJDXZF抑制HCC细胞增殖、迁移并促进凋亡：体外实验表明，JPJDXZF含药血清能显著降低HepG2和MHCC97-H细胞的活力（IC50约为10%），增加细胞凋亡比例，并抑制细胞的迁移能力。同时，JPJDXZF处理下调了BIRC5、YAP、TAZ的mRNA和蛋白表达水平。
- 3.
JPJDXZF抑制HCC类器官生长：成功构建了保留原发肿瘤病理特征（高表达Arg-1和CK18）的HCC患者来源类器官。JPJDXZF含药血清处理显著减小了类器官的直径，降低了其ATP活性，并下调了增殖标志物Ki67的表达。qRT-PCR检测同样显示BIRC5、YAP、TAZ的mRNA表达下调。
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JPJDXZF抑制裸鼠移植瘤生长：在HepG2细胞皮下移植瘤裸鼠模型中，JPJDXZF灌胃治疗显著减少了肿瘤的体积和重量。肿瘤组织分析显示，JPJDXZF组中BIRC5、YAP、TAZ的mRNA和蛋白表达水平以及Ki67阳性率均低于对照组。
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机制探讨：JPJDXZF通过Hippo-YAP/TAZ轴调控BIRC5：机制研究表明，JPJDXZF处理增加了Hippo通路核心激酶MST1/2和LATS1的磷酸化水平，促进了YAP/TAZ在丝氨酸位点（Ser127 for YAP, Ser89 for TAZ/ WWTR1）的磷酸化，导致YAP/TAZ滞留在细胞质中，核内YAP/TAZ减少，进而降低了TEAD依赖的转录活性和下游靶基因BIRC5的表达。通过siRNA干扰MST1/2（siMST1/2）部分逆转了JPJDXZF对细胞活力、凋亡、迁移的抑制作用，并恢复了YAP/TAZ的核定位、TEAD活性及BIRC5的表达。同样，使用Hippo通路调节剂EMT inhibitor-1处理或过表达BIRC5（BIRC5-OE），也部分减弱了JPJDXZF对HCC细胞的上述抑制效应。
讨论
本研究综合运用网络药理学、生物信息学及多层次实验模型，首次系统地将JPJDXZF的抗HCC作用与Hippo信号通路激活及下游靶点BIRC5的调控联系起来。BIRC5作为重要的凋亡抑制蛋白，其过表达与HCC的不良预后、复发及治疗抵抗相关。本研究发现JPJDXZF能下调BIRC5的表达，这与其抑制细胞增殖、促进凋亡的表型一致。通路富集及实验验证均指向Hippo-YAP/TAZ-BIRC5轴在这一过程中扮演关键角色。JPJDXZF可能通过激活Hippo通路核心激酶级联反应，抑制YAP/TAZ的转录活性，进而下调BIRC5，最终发挥抗HCC效应。类器官和动物实验的结果与细胞实验相互印证，增强了研究结论的可靠性与转化意义。本研究为JPJDXZF的临床应用提供了分子机制层面的实验依据，也为靶向Hippo通路治疗HCC提供了新的思路。
结论
综上所述，本研究揭示健脾解毒消癥方（JPJDXZF）能够抑制肝细胞癌（HCC）细胞的增殖与迁移，并促进其凋亡，其作用机制与调控Hippo信号通路、抑制其下游效应子YAP/TAZ的活性、进而降低关键靶基因BIRC5的表达密切相关。这项研究为JPJDXZF治疗HCC提供了实验依据和机制阐释。
