探究乳球菌噬菌体Skunavirus中保守HNH内切核酸酶基因hrdP在DNA包装中的关键作用及其作为抗噬菌体靶点的潜力

《Microbial Biotechnology》：Functional Evaluation of a Conserved HNH Endonuclease Gene in Lactococcal Skunavirus Genomes

这篇综述聚焦于乳制品发酵行业的主要威胁——Skunavirus噬菌体，深入探究了其基因组中一个高度保守的HNH内切核酸酶基因（hrdP，与DNA包装相关）的功能。研究表明，hrdP编码的蛋白（HrdP）对噬菌体DNA包装的完成至关重要，其缺失虽不影响DNA复制和蛋白合成，但会导致噬菌体颗粒无法成熟，从而丧失感染性。这项工作首次在Skunavirus中揭示了HrdP在DNA包装中的必需角色，为开发以HrdP为靶点的新型抗噬菌体策略、增强发酵剂菌株的鲁棒性提供了新的理论依据。

　　

在乳制品发酵工业中，Skunavirus（原称936群）是导致牛奶酸化失败或效率低下的最主要、最常见的乳酸乳球菌噬菌体。噬菌体感染过程中，DNA被包装进预先组装好的衣壳内是一个关键的成熟步骤。在Skunavirus属中，一个预测的HNH内切核酸酶编码基因，位于两个推定的DNA包装基因之间，高度保守。本研究将其命名为hrdP（HNH内切核酸酶，与DNA包装相关），并揭示了其在Skunavirus sk1产生感染性病毒粒子中扮演着不可或缺的角色。

HrdP具有典型的HNHE蛋白特征

通过对228个乳品源Skunavirus成员的基因组分析发现，hrdP基因普遍存在，其编码的蛋白质序列高度保守。对sk1菌株HrdP蛋白的分析表明，其氨基酸序列包含HNH内切核酸酶（HNHE）活性所必需的三个保守残基（H⁴⁹， N⁶⁹和 H⁷⁸）。结构预测显示，HrdP具有典型的ββα-金属折叠结构，并预测了两个可能的Zn²⁺离子结合位点。

HrdP展现出非特异性的内切核酸酶活性

实验纯化的HrdP蛋白能非特异地降解多种DNA底物，包括含cos位点的PCR产物、sk1基因组DNA以及质粒DNA。其活性在Mn²⁺存在时最高，但无论使用何种二价金属离子（Mn²⁺， Mg²⁺或 Zn²⁺）或何种酶浓度，均未观察到序列特异性的切割。

hrdP的缺失严重削弱了噬菌体sk1的噬斑形成能力

利用CRISPR-Cas9基因编辑技术成功构建了sk1ΔhrdP突变体。在缺乏hrdP反式互补的宿主中，该突变体的噬斑形成效率（EOP）极低（< 10^-4），表明HrdP对于sk1形成噬斑是必需的。少量在非互补宿主中形成的噬斑，经基因型鉴定均为通过同源重组恢复了hrdP基因的回复突变株。

HrdP不参与DNA复制或结构蛋白合成

定量PCR（qPCR）分析表明，在非互补宿主中，sk1ΔhrdP的DNA复制水平与互补对照组相当，并未受到影响。相反，已知能抑制DNA复制的流产感染系统（AbiP）则显著抑制了DNA复制。蛋白质印迹（Western blot）分析也显示，在有无HrdP互补的条件下，感染细胞中主要衣壳蛋白和尾蛋白的合成水平没有明显差异。这些结果表明，HrdP很可能不直接参与DNA复制或结构蛋白的合成。

hrdP的缺失影响子代噬菌体的成熟

在含有或不含HrdP互补的不同感染复数（MOI）下，监测了宿主细胞的生长曲线。在MOI=10时，互补与非互补宿主的生长均被完全抑制。但在MOI=5和MOI=1时，非互补宿主在感染后期（分别为约110分钟和80分钟后）出现了生长恢复，而互补宿主生长持续受抑。这表明hrdP的缺失影响了子代噬菌体的成熟或传播，导致裂解周期受阻。透射电子显微镜（TEM）观察直接证实了这一点：在非互补宿主中繁殖的sk1ΔhrdP，绝大多数颗粒是缺陷型的，几乎看不到完整的病毒粒子；而在互补宿主中，则能产生DNA包装完整的正常颗粒。

DNA包装的启动在缺乏HrdP时仍可发生

为了探究HrdP在DNA包装过程中的具体作用，研究还构建了另外两个关键基因的缺失突变体作为对照：sk1ΔterS（无法启动DNA包装）和sk1Δhtc1（无法组装头尾结构）。TEM观察发现，sk1ΔterS的前头（prohead）尺寸较小且均一，而sk1Δhtc1和sk1ΔhrdP的前头则表现出更大且尺寸多变的特点。已知在DNA易位过程中，当包装完成度达到10%至25%时，衣壳会发生膨胀（扩张可达15%）。sk1ΔhrdP前头观察到的膨胀现象表明，DNA包装的启动和部分进展在缺乏HrdP时仍然发生了，但过程可能在此后停滞，无法完成最终组装。

HrdP与末端酶蛋白的潜在复合物形成

尝试在异源表达系统中检测HrdP与末端酶大亚基（TerL）的相互作用。然而，在共表达His标签的TerL和HrdP后，进行镍柱亲和层析，HrdP并未与TerL共洗脱，而是大部分存在于流穿液中，表明在该实验条件下两者未形成稳定的复合物。计算预测也未能给出两者相互作用的可靠模型。作为阳性对照，共表达的His标签的末端酶小亚基（TerS）和TerL则成功实现了共洗脱，证实了TerS-TerL复合物的形成。

讨论与结论

本研究首次在Skunavirus噬菌体sk1中功能鉴定了保守的HNH内切核酸酶HrdP，并证明其对DNA包装的完成至关重要。HrdP表现出非特异性的内切核酸酶活性。虽然其具体作用机制尚未完全阐明，但可能与辅助cos位点切割或作为解离酶（resolvase）清除DNA复制产生的分支结构（如霍利迪连接体）以利于包装有关。在缺乏HrdP时，DNA包装启动并部分进展（导致衣壳膨胀），但过程无法完成，无法产生成熟的感染性病毒粒子。

鉴于Skunavirus在乳业中的巨大影响，以及HrdP在该属中的高度保守性和特异性（其他乳酸菌噬菌体属如Ceduovirus中不存在），使其成为一个极具潜力的新型抗噬菌体靶点。针对HrdP开发抑制策略，有望特异性干扰Skunavirus的DNA包装，从而保护发酵剂培养物，增强工业发酵过程的鲁棒性。这项工作为深入理解噬菌体DNA包装的复杂机制以及开发针对性的防控手段提供了新的视角和重要依据。