由于亚硝酸盐胁迫，在反硝化除磷污泥中，Accumulibacter的代谢特性表现出较强的灵活性，同时IIC支系的菌株占比显著增加

《Process Safety and Environmental Protection》：The flexible metabolism of Accumulibacter and prevalence of clade IIC due to nitrite stress in a denitrifying phosphorus removal sludge

硝酸盐浓度和碳源类型影响Accumulibacter代谢及属群结构，长期驯化系统下IIC属群主导且耐受硝酸盐胁迫，丙酸碳源系统除磷效率更高。

　　

马娟|金海东|田文清|万鹏|张一晨|李哲|郭玉军|马新尧|王鹏|于晓军

兰州交通大学环境与市政工程学院，中国兰州730070

摘要

为了了解在长期适应的脱氮除磷系统中Accumulibacter的代谢反应及其分支的变化，本研究分别使用乙酸钠和丙酸作为碳源，在不同的亚硝酸盐浓度下对两个序批反应器进行了研究。Accumulibacter的分支能够根据可用的电子受体灵活调整其代谢方式。当亚硝酸盐成为缺氧条件下磷去除的限制因素时，Accumulibacter的代谢方式转变为典型的厌氧磷释放。过量添加电子受体也会导致磷吸收能力下降，因为聚β-羟基烷酸（PHAs）的降解不仅为磷吸收提供能量，还用于亚硝酸盐的还原和解毒。实时定量PCR（qPCR）分析显示，即使在亚硝酸盐胁迫条件下，IIC分支仍然是主要群体。此外，聚磷酸盐积累菌Accumulibacter的IIC分支被认为是对亚硝酸盐胁迫最具耐受性的分支，并且负责在这种胁迫条件下的代谢转变。

引言

增强型生物除磷（EBPR）因其经济和生态效益而在市政污水处理厂（WWTPs）中得到广泛应用（Martín等人，2006年）。EBPR通过利用聚磷酸盐积累菌（PAOs）来实现磷的去除，这些细菌通过厌氧和缺氧/好氧操作得到富集，最终通过过量污泥排放实现磷的去除。

20世纪90年代，Kuba等人（1993年）发现了脱氮聚磷酸盐积累菌（DPAOs），它们与传统的聚磷酸盐（poly-P）菌不同，因为它们使用NO₃^?/NO₂^?作为电子受体，从而同时实现氮和磷的去除。Candidatus Accumulibacter（以下简称Accumulibacter）被认为是负责磷去除的关键属，无论使用何种电子受体。在厌氧阶段，Accumulibacter分支通常通过主动运输将挥发性脂肪酸（VFAs）导入细胞并以PHA的形式储存（Du等人，2025年；Liu等人，2025年）。它们的代谢主要来源于细胞内聚磷酸盐（poly-P）的水解。通过糖酵解分解糖原（Gly）同时提供以NADH形式的还原力，并节省少量能量（Li等人，2025年）。在缺氧/好氧阶段，废水中吸收的过量磷以聚磷酸盐的形式储存，细胞内的糖原水平得到恢复，这一过程的能量来源于PHA的氧化（Chen等人，2023年；Izadi等人，2021年；Zhang等人，2024年）。

近年来，Accumulibacter的多样性和功能逐渐清晰。Accumulibacter谱系包含两种主要的系统发育类型，即I型和II型（分别称为PAO I和PAO II），这两种类型都编码聚磷酸盐激酶1（ppk1）。每种类型进一步分为几个不同的分支，PAO I分为IA–IE亚型，PAO II分为IIA–III亚型（Camejo等人，2016年；He等人，2007年）。Accumulibacter分支利用NO₃^?/NO₂^?作为电子受体的能力一直存在争议。Flowers等人（2009年）的研究表明，IA分支的Accumulibacter能够在磷吸收过程中使用硝酸盐作为电子受体，而IIA分支则不具备这种能力。相反，Kim等人（2013年）使用FISH-MAR技术得出了不同的结果，表明IA、IIA、IIIC或IIF分支都无法利用硝酸盐。最近的一项研究观察到，在富含IC分支的系统中，当使用硝酸盐作为电子受体时，不会发生脱氮除磷（Rubio-Rincón等人，2019年）。这些结果与Saad等人（2016年）的研究一致，他们发现当使用硝酸盐作为电子受体时，IC分支不会显著吸收磷酸盐，但可以将亚硝酸盐还原与磷吸收结合起来（Saad等人，2016年）。然而，其他研究得出了相反的结论，认为当硝酸盐作为电子受体时，IC分支具有完整的脱氮途径（Camejo Pamela等人，2019年）。尽管如此，关于Accumulibacter是否能够利用硝酸盐或亚硝酸盐的不确定性主要集中在PAO I分支上。相比之下，PAO II分支似乎只能在以亚硝酸盐作为电子受体的情况下进行脱氮除磷（Carvalho等人，2007年；Flowers等人，2009年；Wang等人，2014年）。此外，许多研究表明，在实验室培养的以亚硝酸盐为电子受体的脱氮除磷系统以及实际的WWTPs中，PAO II分支在Accumulibacter分支中占主导地位（Camejo等人，2016年；Kim等人，2013年；Mao等人，2015年；Oehmen等人，2010年；Tian等人，2017年；Zeng等人，2017年；Zeng等人，2016年；Zeng等人，2018年）。此外，PAO II的优势不受地区、温度、水质以及系统是否能够进行EBPR等影响因素的影响。

与传统生物除磷方法相比，亚硝酸盐型脱氮除磷方法在处理低C/N比废水时具有显著的节能优势。在温度升高、污泥停留时间缩短、溶解氧有限、酸性条件以及碳氮比不足的特定运行情况下，亚硝酸盐倾向于在系统中积累，因为氨氧化的速度超过了亚硝酸盐氧化的速度（Ma等人，2016年；Zhou等人，2011年）。然而，亚硝酸盐本身或其质子化产物游离亚硝酸（FNA）会对许多WWTP中的微生物产生不利影响，从而减缓或停止微生物的代谢活动（Pijuan等人，2010年）。研究表明，亚硝酸盐在低浓度下可作为电子受体，但在高浓度下会抑制缺氧条件下的磷吸收。在极高浓度的亚硝酸盐下，脱氮除磷系统会停止磷的吸收并表现出磷的释放（Lee等人，2001年；Saito等人，2004年）。Zhou等人（2007年）认为，FNA才是真正限制微生物代谢活动的抑制剂，而不是亚硝酸盐本身的抑制作用。其他研究也证实了FNA的抑制作用（Pijuan等人，2010年；Zhou等人，2011年；Zhou等人，2008年）。然而，后来发现系统pH值是影响脱氮除磷的更重要因素（Weng等人，2014年）。很少有研究关注主要响应亚硝酸盐胁迫的EBPR Accumulibacter的代谢及其分支群落结构的变化。因此，本研究旨在（1）通过选择性地适应对亚硝酸盐胁迫具有强耐受性的微生物群落，实现高效稳定的脱氮除磷性能；（2）研究Accumulibacter对不同碳源的亚硝酸盐耐受性；（3）阐明响应各种亚硝酸盐胁迫的Accumulibacter的代谢方式；（4）研究在高亚硝酸盐胁迫条件下Accumulibacter的分支水平变化。

反应器建立和操作

本研究使用了两个实验室规模的SBR（R1和R2），进水水质和亚硝酸盐投加量有所不同，其他参数保持一致。反应器由有机玻璃制成，工作体积为4.2升。通过曝气泵将空气输送到系统中以维持氧气供应。安装了搅拌器以确保反应器内的充分混合。实验装置由计时器控制，以确保循环之间的连续运行。

为了阐明

不同亚硝酸盐浓度下的营养物质去除性能

图1显示了在不同亚硝酸盐浓度条件下，使用多种碳源的脱氮除磷系统的营养物质去除效率。当R1系统中使用乙酸钠时，当NO₂^?-N的投加量为5毫克/升和10毫克/升时，PO₄³-P和NH₄⁺-N的去除效率均超过了90%（图1(a)）。然而，NO₂^?-N的去除效果不理想，平均去除效率分别为74.60%和84.30%，可能是因为添加了2毫克/升的ATU

结论

使用长期适应的脱氮除磷系统揭示了Accumulibacter在亚硝酸盐胁迫下的代谢机制及其分支水平的群落结构。碳源的类型是决定系统亚硝酸盐耐受性的关键因素之一。使用丙酸作为单一碳源的系统的磷去除性能明显优于使用乙酸钠作为碳源的系统

CRediT作者贡献声明

金海东：撰写——原始草案，研究。 马娟：撰写——审阅与编辑，可视化。 万鹏：研究，数据管理。 田文清：验证，监督。 李哲：概念构思。 张一晨：软件开发。 郭玉军：方法学研究。 王鹏：监督。 马新尧：数据管理。 于晓军：数据管理，概念构思。

利益冲突声明

作者声明以下可能被视为潜在利益冲突的财务利益/个人关系。马娟报告获得了中国国家自然科学基金的支持。马娟还获得了兰州人才创新与创业项目的支持。于晓军获得了甘肃省自然科学基金的支持。如果有其他作者，他们声明

致谢

本研究得到了中国国家自然科学基金（项目编号52060013）、兰州人才创新与创业项目（项目编号2019-RC-109）以及甘肃省自然科学基金（25JRRA953）的财政支持