使用ELISA和LC-MS/MS方法比较血浆和血清中特异性促消退介质的定量情况

《Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids》：Comparing the quantitation of specialized pro-resolving mediators in plasma and serum using ELISA and LC-MS/MS

【字体：大中小】 时间：2026年03月09日 来源：Prostaglandins, Leukotrienes and Essential Fatty Acids 2.9

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　　本文对比了酶联免疫吸附试验（ELISA）与液相色谱-串联质谱联用技术（LC-MS/MS）在检测脂氧素（如RvD1、RvD2）中的差异，发现ELISA存在显著高估现象，且样品处理不当会增强假阳性信号。结论指出，ELISA需经LC-MS/MS验证方可确保数据准确性。

卡迪夫大学系统免疫研究所医学院，英国卡迪夫，CF14 4XN

摘要

氧化脂质的定量通常使用液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）联用技术进行。由于便利性或仪器限制，研究人员也可以使用商业化的酶联免疫吸附测定（ELISA）方法。然而，氧化脂质是小分子，具有许多异构体和代谢物，使用ELISA难以完全区分，且存在多种潜在的交叉反应来源。本文将ELISA与LC-MS/MS在氧化脂质分析中的效果进行了比较，并以两种特定的前体分解介质（SPM）为例进行了研究。通过文献回顾，我们发现ELISA报告的resolvin D1（RvD1）和resolvin D2（RvD2）的水平显著高于LC-MS/MS的结果。此外，实验表明，在LC-MS/MS未能检测到这些脂质的血浆和血清样本中，ELISA仍能得到阳性结果，并且这些信号会因样本处理不当而增强。因此，虽然ELISA可以用于检测氧化脂质的存在，但阳性结果需要通过LC-MS/MS进行验证。

引言

对于包括脂质在内的小分子的常规、灵敏定量分析，液相色谱与串联质谱（LC-MS/MS）联用是金标准方法。在分析氧化脂质（多不饱和脂肪酸的生物活性氧化代谢物）时，新一代质谱平台具备快速扫描和保留时间调度功能，能够在约20分钟内定量超过200种脂质，灵敏度可达到皮克（pg）级别[1,2]。这极大地提升了我们识别和定量氧化脂质的能力；然而，这种方法需要较高的成本、时间和专业知识投入。自20世纪70年代以来，基于免疫反应性的方法（如酶联免疫吸附测定（ELISA）或放射免疫测定（RIA）已被开发出来，最初用于检测常见的丰富氧化脂质（如前列腺素E₂（PGE₂）或血栓素B₂（TXB₂），后来扩展到较少见的氧化脂质，包括特定的前体分解介质（SPM）。

ELISA方法用于前列腺素分析已有数十年的历史[3,4]，无需专业知识和昂贵设备即可实现定量。20世纪80年代，人们对免疫测定的定量准确性提出了质疑。例如，一项比较RIA与GC-MS测定6-酮-PGF_1α的研究显示，RIA的结果大约高出10倍[5]。另一项关于异前列腺素分析的ELISA研究得出8-epi-PGF_2α是前列腺素的主要血管代谢物的结论[6]，但这一观点后来被推翻[7]。相比之下，RIA成功用于测量尿液中的6-酮-PGF_1α和TXB₂水平，尽管在进行RIA前需要严格纯化以减少交叉反应[8,9]。最近的研究表明，ELISA在高表达巨噬细胞培养物中高估了PGE₂的水平，尽管ELISA信号对环氧化酶抑制剂敏感，说明其测量的是整个前列腺素途径[10,11]。因此，在这个例子中，ELISA作为氧化脂质途径的筛选工具，识别出的差异随后通过LC-MS/MS得到了验证。2017年也有类似数据发表，显示使用ELISA测得的加工组织样本中PGE₂水平比LC-MS/MS高3倍[12]。尽管ELISA供应商提供了关于类似氧化脂质交叉反应性的信息，但每种ELISA无法检测所有物种的交叉反应性。因此，在复杂样本中仍可能发生未知物种的交叉反应，建议进行验证以确认目标分析物的存在。正如多年前所强调的，除非严格证明ELISA测量的是实际目标代谢物，否则其结果应被视为半定量指标[7]。不幸的是，大多数声称使用ELISA检测到氧化脂质的已发表研究并未进行这种验证，导致出版物中的氧化脂质水平数据具有误导性。

据报道，SPM含量很低，分析难度较大。对许多研究人员来说，使用LC-MS/MS检测SPM极其困难或无法实现，其实际存在于生物样本中的水平也受到质疑[13]。用于测量SPM的LC-MS/MS方法也受到挑战。为解决这一不确定性，最近发布了基于社区的广泛指南[13, [14], [15], [16]]。ELISA与LC-MS/MS结果之间的差异使得SPM的验证变得更加必要。在一项近期研究中，ELISA显示帕金森病患者脑脊液中的RvD1水平显著降低，提示这种脂质在病理过程中可能起作用[17]。该研究仅通过ELISA报告了血浆和脑脊液中RvD1和RvD2的水平（分别为约120 pg/ml和80 pg/ml），未使用LC-MS进行验证[17]。然而，这些血浆水平与其他数据相矛盾，后者显示在室温下长时间储存后SPM才出现[18,19]。这与几十年前的研究结果一致，即非酶促产生的异前列腺素会在血浆中出现[20]。另一项较新的研究使用ELISA（未进行LC-MS验证）声称在关节炎小鼠模型中检测到高水平的maresin 1（MaR1）和lipoxin A₄（LXA₄）[21]。

鉴于文献中的这些矛盾数据以及SPM可能作为非酶促产物产生的担忧，我们通过已发表的数据和实验比较了ELISA与LC-MS/MS在血清和血浆中RvD1和RvD2的分析结果。总体而言，我们发现ELISA分析高估了这两种氧化脂质的水平，包括在LC-MS/MS完全未检测到这些脂质的样本中；并且当样本处理不当时，ELISA检测到的信号会增强，这与LC-MS/MS的最新研究结果一致[18]。

参考文献

文献综述

健康人体内resolvins水平的数值来源于Calder在2020年之前总结的大量研究的原始资料[22]。接下来，通过PubMed搜索（www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed/，访问时间2025年5月），找到了2020年后发表的、包含“resolvin D1”或“resolvin D2”以及“plasma”或“serum”关键词的相关研究。

从血浆或血清中提取脂质

所使用的正常人血浆（Plasma 1）来自英国汉普郡的Alpha Laboratories（https://www.alphalabs.co.uk/ccn-15）。

统计分析显示，使用ELISA测得的血浆和血清中RvD1和RvD2的水平显著高于LC-MS/MS

首先，我们比较了文献中报告的两种SPM的数值，这些数值是通过ELISA或LC-MS/MS测得的。共确定了52项包含健康个体血清或血浆中RvD1或RvD2水平的研究，其中约60%使用的是LC-MS/MS（补充表1-4）。只有一项研究在同一样本上直接比较了ELISA和LC-MS/MS的结果[29]。使用ELISA测得的血清中RvD1水平范围为41.5至6750 pg/ml，平均值为1609 pg/ml，而LC-MS/MS的结果为0.4 pg/ml。

结论

总之，ELISA分析得出的血清和血浆中RvD1和RvD2的水平无法通过LC-MS/MS验证，尤其是在样本处理不当的情况下。这强烈强调了制造商协议中关于正确处理血液和其他生物样本的必要性，并建议使用LC-MS/MS来验证ELISA生成的定量数据。制造商通常会提供数十种物种的交叉反应性数据，但通常无法覆盖所有情况。

资助

感谢医学研究委员会（Medical Research Council，MAP/UK，MR/S010483/1）的资助（VOD, BN）。

CRediT作者贡献声明

Brendon Naicker：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。 Vindya Ramanayake-Mudiyanselage：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析、概念构思。 Tanya Maxey：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。 Victoria J Tyrrell：撰写——审稿与编辑、初稿撰写、方法学设计、实验研究、数据分析。 James Horn：撰写——审稿与编辑、实验研究。