一种近红外波段的、针对线粒体的粘度荧光探针，用于研究癌细胞中的自噬和凋亡过程

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A near-infrared mitochondrial-targeting viscosity fluorescent probe for studying autophagy and apoptosis in cancer cells

线粒体粘度荧光探针BFD的构建及其在自噬/凋亡监测中的应用。本研究开发了一种近红外荧光探针BFD，用于实时监测活细胞中线粒体粘度的动态变化。BFD通过扭曲的分子内电荷转移机制响应线粒体粘度，具有大斯托克斯位移（128 nm）和728 nm发射波长，可特异性靶向线粒体。实验证实BFD能实时追踪自噬和凋亡过程中线粒体粘度的变化，并在斑马鱼模型中得到验证，为癌症早期诊断和治疗评估提供了新工具。

　　

胡浩东|孔晓琪|陈晔|张长月|陈瑞娇

滨州医学院药学院，中国烟台264003

摘要

背景

癌症是严重威胁人类健康的疾病之一。早期诊断癌症可以显著提高治愈率，减轻治疗负担，并有效改善患者的生活质量。细胞内线粒体粘度的异常与癌症的发展密切相关。线粒体粘度的异常会影响能量代谢、信号传导和氧化还原平衡。鉴于线粒体在癌症中的关键作用，监测线粒体粘度水平（尤其是在与癌症发展密切相关的线粒体自噬和凋亡过程中）对于理解癌症发展、早期诊断癌症以及评估癌症治疗效果至关重要。

结果

因此，我们开发了一种针对线粒体的荧光探针BFD，其具有近红外发射波长（728 nm）和较大的斯托克斯位移（128 nm），可用于监测线粒体粘度水平。该探针的带正电荷的苯并噻唑部分用于靶向线粒体并作为电子受体，而呋喃单元用于扩展共轭结构，二乙胺基单元则作为电子供体。BFD在728 nm处具有依赖于粘度的荧光响应。我们成功使用BFD监测了被尼斯塔丁处理的细胞中线粒体粘度的变化。此外，该探针还能实时成像细胞水平上线粒体自噬（由饥饿诱导和雷帕霉素诱导）和凋亡（由依莫丁诱导）过程中的粘度变化。同时，BFD还成功检测到了尼斯塔丁处理下斑马鱼体内粘度水平的波动。

意义

所有结果均证实，探针BFD能够灵敏地监测线粒体粘度的波动，使其成为可视化评估癌细胞自噬和凋亡效应的强大工具。这一能力为癌症的早期诊断和治疗效果评估提供了有希望的策略，从而有助于更精确的治疗监测。

引言

癌症是全球人类死亡的主要原因之一。全球癌症形势复杂而严峻。2022年，全球约有2000万新发癌症病例，约970万患者死于癌症。预计到2050年，新发病例数将增加到3500万，增长约77% [1]、[2]、[3]。因此，开发新的癌症早期诊断工具对于降低癌症死亡率至关重要。

粘度作为细胞微环境中的一个重要物理化学参数，受到了广泛关注。粘度的异常变化会干扰依赖扩散的生化反应，阻碍细胞器间的物质运输，并干扰信号传导，从而促进癌变表型，如不受控制的增殖、上皮-间质转化和耐药性 [4]、[5]、[6]。此外，细胞内粘度的异常变化与多种疾病（如糖尿病、阿尔茨海默病（AD）、帕金森病（PD）和癌症 [7]、[8]、[9]）密切相关。作为真核细胞的“能量工厂”和代谢中心，线粒体粘度的升高可能导致酶活性下降、ATP合成减少以及钙释放和信号传导受阻，从而影响细胞功能。线粒体自噬和凋亡在癌症进展中起着重要作用。癌细胞通过调节线粒体自噬实现代谢重编程，例如它们增强有氧糖酵解（瓦尔堡效应）以提供快速增殖所需的能量。这一过程可能导致代谢物积累，进而增加粘度 [10]、[11]、[12]、[13]。值得注意的是，线粒体粘度的增加也是凋亡的特征之一 [14]、[15]。在此过程中，膜通透性增加、脂质氧化、蛋白质聚集和氧化损伤会累积 [16]、[17]。这些因素会导致线粒体结构重塑，最终引发凋亡 [18]。因此，在细胞水平上实时监测线粒体粘度的波动不仅有助于理解与线粒体相关的生理和病理过程，还为癌症的早期诊断和药物反应评估提供了关键信息。

传统的粘度测量方法（如旋转粘度计、毛细管粘度计和滴球法）仅适用于体外、宏观和静态系统的粘度测量，无法满足活细胞的动态和非侵入性微观测量需求 [19]、[20]。荧光探针具有高灵敏度和特异性、高空间和时间分辨率以及非侵入性等优点 [21]、[22]、[23]、[24]，突破了传统粘度测量在空间尺度、时间动态和生物兼容性方面的局限。它们已成为研究细胞器功能、疾病诊断和药物反应性评估的不可或缺的工具。

在这里，我们合理设计了一种针对线粒体的荧光探针BFD，其具有近红外发射波长（图1），用于监测活细胞中的线粒体粘度水平。利用BFD，我们成功监测了肿瘤细胞自噬和凋亡过程中线粒体粘度的变化，为研究细胞生理过程提供了重要信息。此外，BFD还成功用于成像斑马鱼中的粘度变化，展示了其多功能性和良好的适用性，为研究活体生物中的动态过程提供了新的工具，并进一步证明了BFD在生物医学研究中的潜在应用。

材料与仪器

所有药物和试剂均从商业试剂供应商处购买，直接使用无需进一步纯化。紫外光谱测试在紫外-可见光谱仪（Evolution 220）上进行，荧光光谱测试在荧光光谱仪（Hitachi F-4700）上进行，核磁共振（NMR）谱在Bruker（AVIII 500）上进行，细胞和斑马鱼荧光成像在奥林巴斯激光共聚焦显微镜（FluoView? FV1000）上进行。详细信息...

探针BFD

的设计

探针的核心是一个带正电荷的苯并噻唑单元，它作为电子受体（A），赋予分子线粒体靶向能力。通过引入呋喃片段形成延长的共轭桥（π），有效延长了电荷分离状态并增强了荧光发射。同时，在共轭系统的末端引入了亲脂性的二乙氨基团作为电子供体（D），形成了典型的D-π-A结构...

结论

总之，我们基于扭曲的分子内电荷转移机制构建了一种荧光探针BFD》，用于监测线粒体粘度水平。该探针具有近红外发射波长（728 nm）和较大的斯托克斯位移（128 nm），具有优异的选择性和抗干扰能力。我们通过密度泛函理论（DFT）计算进一步验证了BFD对粘度响应的潜在机制。通过共定位成像实验确认了BFD的线粒体靶向能力。

CRediT作者贡献声明

胡浩东：撰写——原始草稿，正式分析，数据管理。孔晓琪：验证，数据管理。陈晔：验证，数据管理。张长月：验证，数据管理。陈瑞娇：撰写——审稿与编辑，资金争取。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的财务利益或个人关系。

致谢

我们感谢国家自然科学基金（编号21807041）和济宁医学院林和院士新医学与临床转化工作站（编号JYHL2022ZD04）的财政支持。