解耦羧基位置与环化位点对双区域异构体苯并吲哚荧光团的光诱导变色（ICT）现象、pH响应以及血清白蛋白结合能力的影响

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：Decoupling carboxyl position and annulation site effects on ICT, pH response, and serum albumin binding in dual-regioisomeric benzoindole fluorophores

基于苯并吲哚的D-A荧光探针BI-1、BI-2、BI-3的合成及其与血清白蛋白（BSA）和人类血清白蛋白（HSA）的相互作用研究表明，羧酸取代位置和苯并吲哚融合模式显著影响探针的光物理性质（如吸收/发射光谱、荧光量子产率、pH响应性）及蛋白结合特性（结合位点、亲和力）。分子对接和竞争结合实验证实，结构差异导致探针与BSA和HSA的结合模式及荧光增强机制不同，其中BI-1表现出pH依赖性荧光响应，而BI-2、BI-3在蛋白结合后荧光显著增强。这为优化D-A荧光探针的结构-性能-结合关系提供了理论依据。

　　

作者：安国仁（Anguo Ren）、陈久阳（Jiuyang Chen）、李婷婷（Tingting Li）、甘永义（Yongyi Gan）、张博宇（Boyu Zhang） 单位：大连医科大学医学实验室，中国大连116044

摘要

本研究报道了基于苯并吲哚骨架的三种供体-受体（D-A）荧光探针（BI-1、BI-2和BI-3）的合成。系统地探讨了羧基取代位置和苯并吲哚融合模式对其光物理性质及蛋白质结合行为的影响。光谱分析与分子对接实验表明，细微的结构变化会导致吸收和发射特性、荧光量子产率、pH响应性以及对血清白蛋白的结合倾向出现显著差异。对接研究结合位点特异性竞争性结合实验揭示了这些探针与牛血清白蛋白（BSA）的独特结合位点和相互作用模式，而与人血清白蛋白（HSA）的互补对接则提供了结构上的比较信息。值得注意的是，BI-1在酸性条件下表现出明确的pH依赖性荧光响应，且蛋白质结合对其荧光影响较小；而BI-2和BI-3在结合蛋白质后荧光强度显著增强。这些结果强调了苯并吲哚骨架的微小修饰如何显著改变电子性质、质子化行为和蛋白质结合模式。总体而言，本研究为基于苯并吲哚的D-A体系建立了明确的结构-性质-结合关系，为功能性荧光分子的合理设计提供了机制上的见解和指导原则。

引言

供体-π-受体（D-π-A）荧光染料因其微环境敏感的分子内电荷转移（ICT）行为而成为分子传感和高分辨率生物成像的重要结构平台[1][2][3]。通过调节供体/受体部分的电子效应和构象自由度，这些染料能够在可见光到近红外（NIR）光谱范围内实现可调的吸收和发射特性。这些荧光团对局部环境参数（如极性、氢键网络和粘度）具有明显的响应性。具体来说，ICT状态对介电环境的波动敏感，而空间不受限制的系统可以形成扭曲分子内电荷转移（TICT）状态，从而引入非辐射性的失活途径，这与分子的旋转自由度相关[4][5][6]。在各种杂环骨架中，基于苯并吲哚的荧光团因其扩展的芳香π体系和相对刚性的骨架而脱颖而出，通常具有优异的光稳定性和高摩尔吸光度。这些优点为构建高亮度成像剂和环境响应性探针奠定了坚实的基础[7][8]。因此，基于苯并吲哚的D-π-A荧光团已被广泛用于开发用于监测微环境参数（包括局部pH值、极性和粘度）的“开启型”或比率型传感器[6][9][10][11]。 然而，最近的研究发现了一个影响许多体内使用的基于ICT的D-π-A探针的关键问题：与血清白蛋白的非预期相互作用会产生虚假荧光。血清白蛋白[12]（血液中最丰富的蛋白质）可以结合疏水性荧光染料，尤其是那些具有扭曲分子内电荷转移（TICT）结构的染料，并导致荧光强度显著增强[13][14]。实际上，染料-蛋白质结合将荧光团限制在蛋白质的疏水口袋中，限制了D-A对的旋转自由度，使分子处于更平面的、发射性的构象。因此，原本在溶液中弱荧光或无荧光的探针在结合白蛋白后可能会发光——这种效应与探针对实际分析物的响应无关。这种由蛋白质引起的“假阳性”信号可能会掩盖或扭曲目标分析物的真实分布，从而影响定量成像和空间分辨率[15]。事实上，白蛋白干扰已被认为是影响体内开启型荧光探针准确性的常见问题。（值得注意的是，一些研究有意利用白蛋白结合来延长探针的循环时间或提高稳定性[11][16][17][18]，但对于特定分析物的传感器来说，这种非特异性激活是极具问题的。） 除了这种非共价的伪开启效应外，血清白蛋白还可以与某些染料发生化学相互作用。人血清白蛋白在Cys34位置含有自由巯基以及多种胺类和酚类残基，并且其表面可以携带过渡金属离子。因此，带有亲电基团或易氧化基团的探针在白蛋白存在下可能会发生共价修饰或氧化。例如，花青素染料可以通过非共价方式或通过共价结合到蛋白质的亲核位点与白蛋白结合。此类反应会消耗探针或改变其结构（甚至产生荧光染料-蛋白质加合物），从而在校准探针响应或解释成像数据时引入系统误差[9][19][20][21]。总的来说，这些多种探针-白蛋白相互作用方式使得基于ICT的荧光团在复杂生物流体中的使用变得复杂，突显了需要采取结构策略来减轻非特异性蛋白质结合的问题。 机制研究表明，D-π-A荧光团的疏水性受体单元是白蛋白诱导荧光的关键脆弱点。当D-π-A染料的供体-受体对发生扭曲时，主要是更灵活的受体部分发生旋转。白蛋白的疏水口袋可以特异性捕获这个可旋转的受体片段，使其固定，从而阻止ICT状态的非辐射性衰减[22][23][24]。实际上，只有这种染料的可扭曲的A基团通常会嵌入白蛋白口袋内，而刚性的π共轭骨架则留在外面。这种“口袋捕获”不仅会开启荧光，也是D-π-A探针在体内的常见失效机制。大多数先前的探针设计侧重于调节供体或阻断/解除其电子供体以控制荧光，而受体对探针行为（及其对白蛋白的敏感性）的结构影响则被忽视。最近的研究开始解决这一不足——例如，通过开发能够“逃脱”白蛋白结合的刚性、共面受体单元。这些研究表明，修改受体是一种有效的策略，可以防止不必要的蛋白质相互作用[15]。尽管最近的研究探索了多种减轻白蛋白干扰的策略，但对荧光团内在区域异构结构的系统调节仍需进一步研究。因此，迫切需要一种合理的设计策略，能够将血清白蛋白结合亲和力与探针的固有传感功能有效分离。这样的结构控制将有助于开发出不同的分子工具：适用于复杂生物流体中的“抗白蛋白”探针（用于高保真成像）和专为诊断蛋白质定量设计的“敏感于白蛋白”的类似物。 在此，我们对基于苯并吲哚的D-A荧光探针进行了比较研究，以阐明羧酸（-COOH）取代基在受体上的位置和苯并吲哚融合位置对其光物理和化学行为的影响。我们设计并合成了三种结构异构体BI-1、BI-2和BI-3，它们都由一个强电子供体4-(二甲基氨基)苯乙烯基通过π桥与苯并吲哚受体核心结合而成，但在羧基取代位置和吲哚芳香环上的融合位置上有所不同（方案1）。值得注意的是，羧基在电子上与受体单元相连，并赋予其亲水性。通过改变其区域异构位置，我们微妙地改变了芳香骨架的平面性、受体端的空间阻碍以及整体π共轭长度。这些结构差异使我们能够探究它们对关键性质的影响：吸收/发射光谱、量子产率、斯托克斯位移和环境响应性（如pH敏感性）。更重要的是，我们研究了羧基位置如何调节每种探针与血清白蛋白的相互作用。以BSA为模型，我们比较了这三种异构体在蛋白质诱导的荧光增强程度、结合亲和力和潜在结合位点偏好方面的差异。我们的结果有助于理解取代模式对苯并吲哚受体在调控ICT发射效率和蛋白质结合倾向中的作用。这种理解对于指导新一代开启型荧光团的分子设计非常有价值——无论是为了最小化生物成像中的假阳性/背景放大，还是利用白蛋白结合来增强成像效果。

一般信息

所有试剂和化学品（纯度≥98%）均从Adamas购买，除非另有说明，否则按收到时的状态使用。所有光谱测量均使用HPLC级溶剂进行。UV-Vis吸收光谱在Shanghai Instrument SP-2500光谱仪上记录，使用1厘米石英比色皿；荧光发射光谱在Hitachi F-4700荧光光谱仪上收集，激发/发射狭缝宽度为10/10纳米。所有测量均在298 K下进行。

合成

BI-1、BI-2和BI-3通过一种高效的两步策略合成，具体步骤见方案1。首先，相应的萘酚（方案1，步骤a-c）在回流条件下与肼水合物反应生成关键中间体。完成后，通过真空蒸馏去除多余的肼和溶剂，然后将所得到的粗中间体直接进行酸促成的分子内环化反应，与3-甲基丁-2-酮反应生成苯并吲哚。

结论

合成了三种基于苯并吲哚骨架的区域异构体供体-受体荧光探针，以评估羧基位置和环化模式对其光物理性质的影响。系统的光谱分析结合分子对接和竞争性结合实验表明，细微的结构修饰通过调节电子共轭和白蛋白结合亲和力，对分子内电荷转移（ICT）效率具有关键影响。

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能会影响本文所述工作的竞争性财务利益或个人关系。

致谢

本研究得到了辽宁省自然科学基金（项目编号2024-MS-161）、辽宁省教育厅基础研究项目（项目编号JYTMS20230563）以及大连医科大学跨学科研究合作项目团队的资助（项目编号JCHZ2023022）的财政支持。