两步法全生物合成腐胺：以葡萄糖为底物通过模块化工程大肠杆菌实现的高效、可持续生产新策略

《Synthetic and Systems Biotechnology》：De novo biosynthesis of putrescine from glucose using engineered Escherichia coli in a two-step process

为应对腐胺（Putrescine）微生物生产中产率和效率的挑战，本研究开发了一种从葡萄糖到腐胺的模块化两步生物合成新工艺。研究者通过代谢工程构建了高产L-精氨酸的工程菌株E. coli ARGFM，经发酵优化后产量达97.6 g/L，产率0.52 g/g。随后，利用另一株工程菌E. coli TAC通过全细胞催化高效转化L-精氨酸为腐胺，最终产量达48.6 g/L，产率0.26 g/gGlucose，达到了目前报道的最高水平。该研究还建立了下游分离工艺，获得纯度99%的腐胺。技术经济分析和生命周期评估表明，此工艺可减少30%的二氧化碳排放，为生物基二胺的工业生产提供了一条可行且高效的策略。

　　

腐胺，一种脂肪族二胺，是尼龙-46等高性能聚合物材料的关键单体，同时在医药领域作为药物前体和生化试剂发挥着重要作用。然而，传统的工业生产依赖于丁二腈的氢化，这个过程需要昂贵的催化剂、产生有毒中间体，并且依赖石油衍生原料。近年来，利用可再生资源、环境友好的微生物生产法虽然受到广泛关注，但其可持续生产在产量和效率方面仍面临巨大挑战。无论是依赖昂贵前体（如精氨酸、鸟氨酸）的全细胞催化工艺，还是受产物毒性和我们对细胞腐胺代谢理解有限所制约的一步发酵法，都难以建立一个从葡萄糖直接、高效合成腐胺的平台。为了突破这些瓶颈，南京工业大学的研究人员独辟蹊径，开创了一种全新的策略。他们在《Synthetic and Systems Biotechnology》上发表的研究，展示了一种模块化的两步法工艺，利用两株分工合作的工程化大肠杆菌，成功实现了从葡萄糖到腐胺的高效从头生物合成。

为了开展这项研究，作者主要运用了以下几项关键技术方法：首先，通过代谢工程与基因组编辑，以大肠杆菌MG1655为底盘，构建了高产L-精氨酸的工程菌株E. coliARGFM，涉及异源表达多个精氨酸合成途径基因、敲除抑制子和降解基因，并整合了精氨酸输出系统。其次，对ARGFM菌株进行了系统的发酵工艺优化，包括培养基碳氮源配比、甜菜碱添加，以及关键参数如接种量、pH和溶解氧（特别是采用20-30%的动态DO控制策略）的精细调控。再者，利用全细胞催化技术，使用另一株预先构建的工程菌E. coliTAC，将富含L-精氨酸的发酵液直接转化为腐胺，并创新性地采用了原位CO₂循环pH自调控策略，利用脱羧反应自身产生的CO₂来维持反应体系pH，减少外源酸碱添加对细胞活力的损害。此外，研究还通过计算辅助的酶工程设计（整合AlphaFold3、ESM3和FoldX进行分子对接与位点预测），对鸟氨酸脱羧酶(ODC)进行了定向进化，获得了活性更高的突变体（E325P）。最后，研究建立了完整的下游分离纯化工艺（包括活性炭脱色、液液萃取和分馏蒸馏），并利用Aspen Plus过程模拟软件对整个分离流程进行了建模，在此基础上完成了技术经济分析(TEA) 和生命周期评估(LCA)，以评估该工艺的经济与环境效益。

3.1. 构建L-精氨酸生产菌株E. coli ARGFM

研究人员以前期研究为基础，构建了高产L-精氨酸的工程菌株。该菌株通过异源表达来自谷氨酸棒杆菌的精氨酸生物合成核心途径基因（argCJBDH等）和来自枯草芽孢杆菌的氨甲酰磷酸合成酶基因（pyrAA/pyrAB），强化了前体供应；通过过表达内源pntA基因解决了辅因子NADPH的再生问题。同时，通过敲除阻遏蛋白基因argR解除了反馈抑制，并删除了多个精氨酸和鸟氨酸降解基因（speC, speF, adiA, astA等），以减少碳损失。此外，还引入了来自谷氨酸棒杆菌的精氨酸输出系统lysE，以促进胞外精氨酸的积累。这些遗传修饰均稳定整合在基因组上，最终得到了菌株E. coliARGFM。在5 L发酵罐中的初步发酵结果显示，该菌株可产65.47 g/L L-精氨酸，但存在溶氧耗竭、副产物乙酸积累等问题。

3.2. 优化工程E. coli ARGFM的发酵工艺以提高L-精氨酸产量

为了提升产量，研究团队对发酵工艺进行了系统优化。在培养基优化方面，确定了最佳葡萄糖浓度为20 g/L；通过测试不同有机氮源，发现酵母提取物有利于产物合成，而牛肉浸膏更促进菌体生长，两者以1:3比例复合时效果最佳，L-精氨酸产量较单一酵母提取物提高31.7%。最终确定有机氮浓度为7 g/L，碳氮比(C/N)为3:1。添加2 g/L的甜菜碱作为代谢增强剂，进一步提高了产量。在发酵条件优化方面，确定了最佳接种量为10%，并使用氨水作为pH调节剂。最关键的是溶解氧(DO)控制策略：在5 L发酵罐中，当仅用空气控制DO时，L-精氨酸产量为71.65 g/L；而通过补充纯氧将DO动态控制在20-30%时，产量大幅提升至97.6 g/L，产率达到0.52 g/g_Glucose，生产效率高达2.03 g/(L·h)。

3.3. 构建工程E. coli TAC全细胞催化合成体系，用于将L-精氨酸发酵液转化为腐胺

获得高产L-精氨酸发酵液后，研究人员利用先前构建的工程菌E. coliTAC（表达精氨酸酶(ARG)和鸟氨酸脱羧酶(SpeC)）进行全细胞催化，将精氨酸转化为腐胺。初步催化实验在10小时内生产了43.4 g/L腐胺。然而，传统工艺中需要频繁添加磷酸来调节pH，这会损害细胞活力。受前人研究启发，本研究创新性地采用了原位CO₂循环pH自调控策略：利用鸟氨酸脱羧反应自身产生的CO₂在密闭体系中溶解来降低和稳定pH。该策略使催化时间缩短至8小时，细胞活力保持良好，最终将97.6 g/L精氨酸高效转化为48.6 g/L腐胺，产率达0.498 g_putrescine/g_arginine。此外，通过计算辅助的酶工程设计对SpeC进行改造，获得了活性显著提高的突变体E325P，在较低细胞浓度下实现了更高的转化效率。该工艺在50 L规模反应器中也成功进行了放大验证。

3.4. 优化腐胺的分离条件

为了从复杂的催化液中获得高纯度腐胺，研究建立了一套下游纯化工艺。首先对催化液进行活性炭脱色，优化后条件为：活性炭浓度15 g/L，温度50°C，时间30分钟，脱色率可达98.45%。脱色后的液体经浓缩、碱化至pH>12后，进行液液萃取。从十种醇类溶剂中筛选出正丁醇(n-butanol)作为最佳萃取剂，并优化了萃取条件：水相与有机相体积比1:1，温度70°C，时间150分钟，萃取率可达83.2%。最后，对萃取后的有机相进行真空分馏蒸馏，通过控制温度分段收集，成功去除了水和正丁醇，最终在135°C下获得了纯度高达99.9%的腐胺产品。不过，此批次工艺的总质量收率仅为24.8%，主要损失发生在蒸馏步骤。

3.5. 过程模拟

为了评估工艺的经济性和环境影响，研究团队使用Aspen Plus软件对分离纯化过程进行了模拟。模拟结果表明，如果将实验中的间歇蒸馏改为连续精馏，分离收率可大幅提升至91.28%。基于此模拟数据进行的技术经济分析(TEA) 预测，该两步法生产腐胺每吨可产生约188.4美元的利润。生命周期评估(LCA) 则显示，与传统的乙二胺化学合成法相比，此生物法工艺可减少约4.2 kg CO₂的排放，碳足迹降低约30%，环境效益显著。

本研究成功开发了一条从葡萄糖从头生物合成腐胺的高效、可持续新路线。其核心创新在于采用了一种“分工合作”的模块化两步法策略：第一阶段，通过深度代谢工程改造和高强度发酵工艺优化，构建了能高效从葡萄糖生产L-精氨酸（97.6 g/L）的专用菌株E. coliARGFM；第二阶段，利用另一株表达精氨酸酶和鸟氨酸脱羧酶的工程菌E. coliTAC，对前一步的粗发酵液进行全细胞催化，并巧妙地利用反应自产的CO₂实现pH自调节，最终以0.26 g/g_Glucose的综合产率生产出48.6 g/L的腐胺，这是目前报道的从头生物合成最高水平。该策略有效避免了单一菌株面临的代谢负担和产物抑制问题，也摆脱了对昂贵纯品前体的依赖。研究还配套建立了下游分离工艺，获得了聚合物级的腐胺产品（纯度99.9%）。更为重要的是，通过过程模拟、技术经济分析和生命周期评估，本研究从工程化和产业化角度证实了该路线的可行性、盈利潜力和环境友好性。这项工作不仅为腐胺的生物制造提供了一条切实可行的工艺路径，也为其他高附加值生物基化学品的生产提供了“代谢分工-过程集成”的创新范式，对推动绿色生物制造产业发展具有重要意义。