《Theriogenology Wild》：Ovulation synchronization and fixed-time artificial insemination in bison using washed frozen sperm
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本期推荐一篇发表于《Theriogenology Wild》的研究论文。面对野生北美野牛因遗传隔离和结核病、布氏杆菌病等地方病威胁种群存续的困境，研究人员为建立和利用野牛基因组生物库，开展了系列优化人工辅助生殖技术的实验。研究比较了不同卵巢同步化方案，并评估了密度梯度离心（DGC）洗涤（含或不含胰蛋白酶）对冷冻野牛精液体内受精能力的影响。结果显示，两种激素同步化方案同等有效，但在DGC洗涤过程中加入胰蛋白酶会显著降低妊娠率，而采用无胰蛋白酶的DGC洗涤可提高妊娠率。这为利用清洁精子进行保护性种群遗传管理提供了关键技术支持。
北美野牛，这个一度在北美大平原上数量庞大的标志性物种，在20世纪初经历了濒临灭绝的浩劫。尽管经历了一个多世纪的保护努力，它们今天仍然是一个受威胁的物种。野牛，无论是平原野牛还是森林野牛，都面临着严重的遗传多样性丧失问题，原因包括奠基者效应、种群瓶颈、遗传漂变和杂交。更棘手的是，现存唯一持续存活的野生野牛种群（黄石国家公园的平原野牛和伍德布法罗国家公园的森林野牛）还存在布鲁氏菌病和结核病等地方性流行病。这些疾病不仅威胁野牛自身的健康，还可能传播给其他野生动物、家畜甚至人类。由这些疫病构成的野生宿主风险，极大地复杂了野牛的种群恢复工作，因为严格的检疫措施阻碍了受影响种群与其他种群间的自由交流，加剧了遗传隔离和多样性丧失。
在这样的背景下，利用辅助生殖技术建立野牛种质资源库，通过收集、消毒和冷冻保存配子（精子和卵母细胞），再利用这些冷冻保存的遗传物质来恢复和扩大健康种群，成为突破这一遗传学和流行病学困局的一个潜在解决方案。然而，要使这项技术真正应用于保护实践，其流程必须高效、可靠。其中，从可能携带病原体的野生公牛体内获取清洁、优质的精子，并通过定时人工授精（FTAI）在同步排卵的母牛体内成功受孕，是技术链条中的关键环节。这涉及到两个核心问题：如何有效同步母牛的卵巢周期以确保精确授精时机？以及，如何在不损害精子受精能力的前提下，彻底清除精液样本中可能携带的病原体？
为了回答这些问题，由Sergio E. Pezo、Dylan R. Farmer、Steve X. Yang、Muhammad Anzar、Kosala Rajapaksha、Gabriela Mastromonaco、Devinda Wickramasingha、Jaswant Singh和Gregg P. Adams组成的研究团队，在萨斯喀彻温大学西部兽医学院进行了一项系列研究，其成果发表在《Theriogenology Wild》上。研究人员的目标是改进现有的辅助生殖技术，以建立和部署一个野牛基因组生物库，从而恢复和维护受遗传隔离和地方病威胁的野生野牛的种群生存力。为此，他们设计并连续进行了5项实验，系统地开发了使用冷冻前洗涤精液进行卵巢同步化和定时人工授精（FTAI）的方法。研究的主要发现挑战了常规认知：尽管包含胰蛋白酶的密度梯度离心（DGC）洗涤法在清除病原体方面有优势，且常规精液分析未显示其有损精子质量，但它却会严重损害野牛精子的体内受精能力。相反，采用不含胰蛋白酶的DGC洗涤程序，能获得更高的妊娠率。
为了完成这项研究，研究人员运用了几个关键技术方法。他们利用液压保定架和电刺激法从成熟的野生或圈养平原野牛和森林野牛体内采集精液。在卵巢同步化方面，比较了两种主要方案：一种是基于雌二醇+孕激素（E+P）的类固醇方案，另一种是使用高剂量促性腺激素释放激素（GnRH）的方案，两种方案均结合了孕酮缓释阴道装置（PRID）和前列腺素F2α类似物（PGF）进行黄体溶解。在精液处理上，核心是密度梯度离心（DGC）洗涤技术，使用硅烷包被的硅胶（BoviPure）形成不连续梯度（40%和80%）来分离和收集精子，并对比了在该过程中添加或不添加胰蛋白酶的效果。洗涤后的精液使用含卵黄的tris缓冲液（TEYG）作为冷冻保护剂进行稀释，并通过程序化冷冻或蒸汽冷冻法进行冷冻保存。对于母牛的生殖状态监测和妊娠诊断，则全程依赖经直肠超声检查来追踪优势卵泡、排卵和黄体（CL）的形成。精液质量的评估则综合采用了计算机辅助精液分析（CASA）、形态学染色、流式细胞术检测质膜和顶体完整性，以及DNA碎片化分析等多种实验室检测手段。
3.1. 实验1：使用DGC胰蛋白酶洗涤冷冻精液对野牛进行卵巢同步化以实施定时人工授精
研究人员在排卵季节初期，比较了E+P方案和高剂量GnRH方案。所有母牛在授精时均使用经过DGC洗涤（含胰蛋白酶）并冷冻保存的精液。结果显示，两组的排卵率（合计85%）和从首次授精到排卵的间隔（1.3天）没有差异，但妊娠率却意外地低（合计11%，3/28）。这表明两种同步化方案在诱导排卵方面同样有效，但所使用的洗涤精液可能存在影响受精的问题。
3.2. 实验2：精液洗涤对精子活力和FTAI后妊娠率的影响
为了探究实验1中低妊娠率是否由精液洗涤过程本身导致，研究在排卵季节中期进行。所有母牛使用高剂量GnRH方案同步，并被随机分配接受DGC胰蛋白酶洗涤精液或未洗涤精液进行FTAI。结果，使用未洗涤精液的组获得了29%（4/14）的妊娠率，而使用胰蛋白酶洗涤精液的组妊娠率为0%（0/9），尽管差异未达统计学显著性（P=0.13）。这强烈提示胰蛋白酶洗涤过程对精子体内受精能力有不利影响。
3.3. 实验3：排卵诱导方案的修改
此实验不涉及授精，旨在排卵季节后期比较两种排卵诱导剂（高剂量GnRH vs. 人绒毛膜促性腺激素（hCG））在已同步化母牛中的效果。结果显示，两组的排卵率（均为75%）和从诱导治疗到排卵的间隔（合计1.5天）没有差异。这表明在高剂量GnRH方案中，用hCG或高剂量GnRH诱导排卵同样有效。
3.4. 实验4：精液洗涤方案对冻融后精子特性的影响
此实验在实验室中进行，旨在直接评估洗涤程序（特别是胰蛋白酶）对精子质量参数的影响。精液被分为三组：未洗涤、DGC洗涤（不含胰蛋白酶）、DGC洗涤（含胰蛋白酶）。全面的精液分析显示，尽管所有处理组的精子活力在冷冻过程中都有所下降，但DGC洗涤（不含胰蛋白酶）显著增加了具有正常形态精子的比例，并降低了DNA碎片化精子的比例（P<0.01）。令人惊讶的是，常规的精液分析（活力、形态、膜完整性）并未明确揭示出胰蛋白酶洗涤对精子质量的严重损害，这与低妊娠率的结果形成了对比。
3.5. 实验5：比较野牛FTAI的卵巢同步化和精液洗涤方案
基于前期结果，研究在排卵季节末采用2×2因子设计，比较两种同步化方案（E+P vs. 高剂量GnRH）和两种精液处理（DGC洗涤不含胰蛋白酶 vs. 未洗涤）对妊娠率的综合影响。结果再次确认两种同步化方案同样有效。关键发现是，使用不含胰蛋白酶的DGC洗涤精液的母牛妊娠率（8/12，67%）倾向于高于使用未洗涤精液的母牛（2/9，22%）（P=0.08）。
3.6. 对野牛FTAI后妊娠率的回顾性比较
综合全部三个涉及FTAI的实验数据，在总共72头排卵的母牛中，妊娠率存在显著差异（P<0.01）。使用未洗涤精液的妊娠率为26%（6/23），使用含胰蛋白酶DGC洗涤精液的妊娠率仅为8%（3/37），而使用不含胰蛋白酶的DGC洗涤精液的妊娠率最高，达到67%（8/12）。这无可辩驳地表明，在DGC洗涤过程中加入胰蛋白酶对野牛精子的体内受精能力有有害影响。
研究的结论和讨论部分清晰地归纳了上述发现的重要意义。首先，在实践层面上，研究证实了基于类固醇（E+P）和基于高剂量GnRH的卵巢同步化方案对野牛同样有效，且高剂量GnRH方案所需时间更短，避免了类固醇使用的潜在限制。同时，hCG和高剂量GnRH在诱导排卵方面效果相同，为方案选择提供了灵活性。然而，本研究的核心突破在于揭示了精液处理中的一个关键陷阱：尽管密度梯度离心（DGC）洗涤法被广泛认为可用于清除精液中的病原体，且包含胰蛋白酶的DGC程序在之前对野牛精液的初步研究中未显示出对精子常规参数（如活力）的不良影响，但本研究的体内受精实验证明，胰蛋白酶的使用会严重损害野牛精子的受精能力。相反，采用不含胰蛋白酶的DGC洗涤程序，不仅能改善精子的形态和DNA完整性（如实验4所示），更能显著提高FTAI后的妊娠率。
这一发现对建立野牛种质资源库具有直接而深远的影响。它意味着，在从健康状况不明的野生公牛采集精液以进行生物样本库保存时，可以采用不含胰蛋白酶的DGC洗涤法作为优先选择，以期在尽可能去除病原体的同时，最大程度地保留精子的生育潜力。这为通过辅助生殖技术安全、有效地进行野生野牛的遗传救援和种群复壮提供了关键的技术优化方案。当然，研究也指出了未来的方向，例如需要更大规模的实验来进一步优化洗涤、处理和冷冻保存方案，并需要验证DGC程序对清除野牛精液中特定病原体的实际效力。总之，这项研究通过精细的实验设计和严谨的分析，解决了一个保护生物学应用中的关键技术瓶颈，为利用先进生殖技术保护濒危大型哺乳动物提供了宝贵的科学依据和实践指南。
