《Tissue and Cell》：Co-expression of superoxide and peroxide scavenging antioxidant enzymes rescues β cells from hypoxia and hyperglycemia-induced oxidative damage
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β细胞抗氧化酶干预研究：过表达催化酶和SOD2可降低线粒体ROS水平，改善高血糖低氧环境下Min6细胞的存活率及胰岛素分泌功能，为胰岛移植功能提升提供新策略。
E Arunkumar|NK Podh|NK Tuti|G Mehta|Roy Anindya|Subha N Rath
再生医学与干细胞实验室（RMS），印度海得拉巴理工学院生物医学工程系，Kandi-502284，特伦甘纳邦
摘要
胰腺β细胞对于调节葡萄糖稳态和合成胰岛素至关重要。然而，由于抗氧化酶表达水平较低，β细胞容易受到氧化应激的影响。这种应激源于活性氧（ROS）的产生与β细胞的解毒能力之间的不平衡。高血糖和缺氧会诱导ROS的过度产生，从而损害细胞成分并影响胰岛素基因的表达，导致糖尿病的发生。本研究在Min6细胞（一种β细胞模型）中同时表达了针对线粒体的过氧化氢酶和超氧化物歧化酶2（SOD2）。研究了转染细胞和未转染细胞的ROS产生、缺氧诱导以及胰岛细胞相关基因的表达情况。结果显示，转染细胞的ROS水平较低，存活率较高，胰岛素分泌能力更强。关键β细胞功能基因的表达分析表明，抗氧化酶的过表达有助于维持β细胞的身份，这突显了这种方法保护β细胞免受氧化应激损害的潜力。该方法可能减少由缺氧和高血糖引起的胰岛细胞损伤和功能障碍，从而提高糖尿病患者胰岛移植的效果。
引言
胰腺β细胞负责胰岛素的产生和分泌，胰岛素是调节葡萄糖稳态的关键激素（Norton等人，2022年）。与其他细胞类型不同，β细胞中的抗氧化剂、过氧化氢酶（catalase）、超氧化物歧化酶（SOD）和谷胱甘肽过氧化物酶（GPx）的表达水平非常低，使它们特别容易受到氧化应激的影响（Lenzen，2021年）。这种应激源于活性氧（ROS）的产生与β细胞的解毒能力之间的不平衡（Anastasiou等人，2020年）。对于β细胞而言，这种不平衡可能是灾难性的，因为高血糖、缺氧、高脂血症和炎症等常见糖尿病因素往往会引发ROS的过度产生（Benáková等人，2021年）。在正常情况下，ROS是线粒体氧化磷酸化的自然副产品，而线粒体氧化磷酸化对于ATP的产生至关重要（Mukai等人，2022年）。然而，在持续高血糖的情况下，线粒体活性会增强，导致ROS的产生增加（Eguchi等人，2021年）。葡萄糖的自身氧化和NADPH氧化酶的诱导会进一步增加ROS的产生（González等人，2023年）。其后果是：ROS会破坏细胞成分，损伤DNA、蛋白质和脂质，同时影响胰岛素基因的表达和分泌（Baumel-Alterzon等人，2021年）。此外，ROS还会激活NF-κB和JNK等应激敏感通路，促使β细胞走向凋亡和功能障碍，从而加速糖尿病的发展（Dludla等人，2023年）。
β细胞的脆弱性还体现在它们有限的细胞保护酶上。研究表明，β细胞中的SOD活性仅为肝脏中的30%，而过氧化氢酶和谷胱甘肽过氧化物酶的活性仅为5%（Lortz和Tiedge，2003年；Robertson等人，2003年）。这种严重的缺乏使β细胞难以应对氧化应激，因为它们无法在ROS的作用下上调这些酶的表达。认识到这一脆弱性后，科学家们探索了改善β细胞功能的方法。例如，对RINm5F细胞的实验表明，单独过表达过氧化氢酶可以抵抗过氧化氢（H?O?），但不能抵抗超氧自由基（Lortz和Tiedge，2003年）。这一发现强调了需要采取双重策略：同时过表达过氧化氢酶和SOD，以中和超氧自由基和H?O?，从而提供全面的抗氧化保护（Robertson等人，2003年）。在胰岛移植的背景下，这一策略尤为重要，因为胰岛移植是1型和2型糖尿病的一种有前景的治疗方法（Shapiro等人，2017年）。然而，这一过程的成功常常受到缺氧、高血糖和免疫排斥等挑战的阻碍。移植后，胰岛在缺氧环境中难以存活，必须依赖扩散来获取氧气，而新血管的形成可能需要数周时间（Ricordi和Strom，2004年）。在此关键时期，缺氧和高血糖会加剧ROS的产生，导致β细胞死亡和移植失败（Biarnés等人，2002年）。高血糖还会改变基因表达，包括Pdx-1和MafA的表达减少，而这些基因对维持β细胞的身份和功能至关重要（Laybutt等人，2002a）。这些变化会进一步降低胰岛素的表达和分泌，加剧损伤循环（Donath等人，1999年）。
鉴于这些挑战，我们采取了创新策略来增强β细胞的韧性。其中一种方法是在Min6细胞（一种β细胞模型）中同时表达针对线粒体的过氧化氢酶和SOD2。我们希望通过短暂转染质粒来评估过表达抗氧化酶减轻高血糖和缺氧联合影响的潜力。我们假设双转染细胞相比未转染细胞，ROS水平较低，存活率较高，胰岛素分泌能力更强。我们选择2D Min6模型是因为其在缺氧条件下对葡萄糖毒性的高再现性以及抗氧化酶过表达对氧化应激的逆转效果。这些发现揭示了β细胞功能障碍的机制，并指出了改善胰岛移植结果的潜在途径。通过为β细胞提供对抗氧化应激的工具，我们可能打破损伤和功能障碍的恶性循环，为更有效的糖尿病治疗铺平道路。
小节摘录
试剂
除非另有说明，研究中使用的所有试剂均来自Merck公司。
Min6细胞培养
从NCCS（浦那，马哈拉施特拉邦）获得的Min6小鼠胰岛素瘤细胞系（传代36–41）在37°C、含5% CO?的潮湿培养箱中培养，使用添加了10% FBS、2 mM谷氨酰胺和1x青霉素-链霉素的DMEM培养基。缺氧培养在Bioxia（H500，孟买，印度）的缺氧室中进行，条件为3% O?和5% CO?，温度为37°C。
在Min6细胞中过表达ROS清除酶过氧化氢酶和SOD
由于β细胞中抗氧化酶的表达水平较低，因此转染了含有过氧化氢酶和超氧化物歧化酶（SOD2）的质粒以增强这些细胞的抗氧化能力。确认了过氧化氢酶和SOD2的mRNA水平（图1）。与未转染细胞相比，转染细胞中SOD2的表达增加了90倍。过氧化氢酶是一种参与H?O?分解的酶，在转染细胞中的表达增加了48倍（
讨论
本研究表明，过氧化氢酶和SOD的双重表达有助于通过胰岛细胞相关基因的表达来维持β细胞的身份，突显了该策略保护β细胞免受氧化应激损害的潜力。我们进行了一系列实验，包括ROS成像、活细胞/死细胞检测和q-PCR分析，证明了抗氧化酶的过表达能够保护β细胞免受缺氧和高血糖的影响。
胰腺胰岛
结论
总之，本研究表明，过氧化氢酶和SOD2的双重过表达通过减轻氧化应激，有效保持了β细胞的身份和功能，表现为细胞存活率的提高、GSIS的保持、ROS积累的减少以及关键胰岛基因（包括胰岛素、Pdx-1、MafA、Hif-1α和GLUT2）表达的上调。这些发现强调了胰腺β细胞由于其基础表达水平较低而具有的固有脆弱性。
资助
本研究得到了SOCH-IITH资助的项目IITH/BME/F110/SOCH4的支持，该项目名为“开发具有纳米传感器的3D生物打印人工胰腺，用于实时监测胰岛素释放：体外模型替代动物模型进行糖尿病治疗”，该项目由印度政府教育部的IITH资助，资助对象为SNR。
CRediT作者贡献声明
ETTIKUPPAM ARUNKUMAR：撰写——原始草稿、可视化、验证、方法学、研究、数据管理、概念化。Mehta Gunjan：正式分析、资源提供、撰写——审阅与编辑。Roy Anindya：正式分析、资源提供、撰写——审阅与编辑。Podh Nitesh Kumar：方法学、撰写——审阅与编辑。Rath Subha Narayan：撰写——审阅与编辑、验证、监督、资源管理、项目协调、资金争取、正式分析、数据管理，
利益冲突声明
作者声明他们没有已知的可能会影响本文工作的财务利益或个人关系。
致谢
作者感谢大学资助委员会（UGC）提供博士学位奖学金，并在印度海得拉巴理工学院注册。作者感谢Vivek Varma博士在科学讨论、意见稿修改方面的帮助。
作者声明在本文的研究、作者身份或发表方面不存在任何潜在的利益冲突。
