《Veterinary Immunology and Immunopathology》：Evaluation of Cross-Reactivity of Monoclonal Antibodies Against Cytokines and Cellular Molecules of Bovine and Human Origin to Identify Immunological Markers in Buffaloes (Bubalus bubalis)
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水牛免疫系统中商业单克隆抗体的交叉反应性研究及标准化流式细胞术分析。通过评估16种抗细胞标记和细胞因子的单克隆抗体，发现15种在牛和水牛中均有效，仅CD4抗体无交叉反应，为水牛免疫学研究提供标准化工具。
Kelly M.G. Godoy | Maysa S Gon?alves | Ana Carolina Chalfun de Sant’Ana | Carine Rodrigues Pereira | Wanessa A. Carvalho | Fabrizio de Massis | Flavio Sacchini | Elaine M.S. Dorneles | Andrey P. Lage
应用细菌学实验室，预防兽医学系，米纳斯吉拉斯联邦大学兽医学院，贝洛奥里藏特，米纳斯吉拉斯州，巴西
摘要
关于家养水牛免疫系统激活和调节的研究仍然非常有限。这一限制的主要原因是针对水牛免疫标志物的商业单克隆抗体（mAb）供应不足，这些抗体可以用于流式细胞术等多参数技术来研究这些动物的免疫系统调节。评估市售mAb与其他物种在细胞因子和免疫系统成分上的交叉反应性，是扩大评估这些动物免疫反应工具的最快且成本最低的方法。因此，研究人员评估了16种针对细胞标志物（CD4、CD8、CD14、CD21、CD25、CD28、CD45RB、CD45RO、WC1和CD80）以及针对细胞因子或其他免疫系统效应分子（TNF-α、IFN-γ、IL-4、IL-17、颗粒酶B和穿孔素）的商业mAb在水牛和牛的全血样本中的反应性。进行了两项实验：实验1使用6头水牛，评估mAb的结合特异性；实验2使用12头水牛和12头牛，评估mAb的交叉反应性。样本通过流式细胞术进行处理和分析。在分析的mAb中，有15个克隆被验证适用于水牛细胞的流式细胞术分析；只有CD4克隆未显示出对水牛的交叉反应性，这有助于更深入地研究该物种的免疫反应。
引言
家养水牛（Bubalus bubalis）以其强壮的身体和产肉、产奶能力而闻名，同时也被用于劳役（Borghese, 2005; Gama Pantoja et al., 2022）。全球水牛数量约为2.04亿头，其中98%分布在亚洲大陆（FAO, 2023a）。该物种占全球牛奶产量的15%，最大的五个生产国是印度、巴基斯坦、中国、埃及和尼泊尔（FAO, 2023a）。意大利是全球第五大生产国，也是欧洲最重要的生产国，以其水牛马苏里拉奶酪而闻名，这种产品受到欧盟原产地保护制度（PDO）的保护（Minervino et al., 2020）。在发展中国家，约三分之一的牛奶产量来自水牛（FAO, 2023b），而约93.5%的肉类产量集中在亚洲，尤其是印度（FAO, 2023a）。
尽管水牛具有很强的适应性，但它们仍易感染许多影响牛的疾病（如口蹄疫、狂犬病、布鲁氏菌病、结核病、钩端螺旋体病等），尽管它们的临床症状通常不太明显（Borghese, 2005）。然而，关于水牛疾病特性及感染和接种疫苗后免疫反应的信息仍然很少，这可能是由于人们普遍认为水牛具有更强的抵抗力，同时也缺乏相关研究工具。在这方面，流式细胞术是一种重要的工具，可以利用荧光标记的单克隆抗体（mAb）对细胞亚群和细胞内细胞因子进行多参数分析（McKinnon, 2018; Owens et al., 2000）。然而，目前市场上针对水牛的mAb非常少，这限制了对其免疫反应调节机制的深入研究。
尽管已开发出越来越多的针对家养物种和伴侣动物的商业mAb（Entrican et al., 2020），但新mAb的生产过程繁琐、耗时且成本高昂（Pedersen et al., 2002）。鉴于需要在其他具有经济、流行病学和环境重要性的动物物种中进行免疫学研究，现有研究主要关注传统物种（如人类、小鼠和牛）与非模式物种之间的mAb交叉反应性（Davis et al., 1987; Grandoni et al., 2017; Mosaad et al., 2006）。一些研究测试了mAb对人类、牛、山羊、绵羊、狗、猪、水牛、野牛、羊驼和骆驼科动物细胞及细胞因子的交叉反应性（Dorneles et al., 2015; Griebel et al., 2007; Moreira et al., 2015; Mosaad et al., 2006）。此外，还有少数研究测试了牛的标志物对水牛细胞的交叉反应性（Davis et al., 2001; Grandoni et al., 2017; Mosaad et al., 2006），因为这些物种在进化上较为接近，并发现针对牛的mAb可以识别水牛中的保守表位。然而，以往的研究主要集中在MHC I、MHC II和CD抗原等表面分子上，而对细胞因子和效应分子在细胞免疫分析中的交叉反应性的系统研究较少。此外，某些mAb克隆可能结合同一标志物的不同表位，从而导致交叉反应性的差异。因此，应测试针对同一标志物的不同mAb克隆，以增加水牛免疫学研究的试剂可用性。本研究旨在评估商业mAb对水牛中牛和人类细胞标志物及细胞因子的交叉反应性。
单克隆抗体
本研究使用了16种源自小鼠的单克隆抗体，其中10种针对牛的细胞标志物（CD4、CD8、CD14、CD21、CD25、CD28、CD45RB、CD45RO、CD80、WC1），3种针对牛的细胞因子（TNF-α、IFN-γ、IL-4），以及3种针对人类免疫系统成分和细胞因子（IL-17、颗粒酶B和穿孔素）。mAb的特异性、克隆鉴定、荧光标记物、制造商及使用稀释度详细信息见表1。
选定的mAb识别的水牛与牛或人类免疫分子之间的相似性
水牛与...
结果
对表面蛋白和细胞因子的氨基酸序列进行相似性分析后发现，牛和水牛之间的同源性值超过85%（表1和补充表1）。关于细胞因子和人类与水牛免疫系统分子之间的相似性，相似性值在71%到74%之间（表1和补充表1）。
关于结合特异性评估，图3和图4显示了...
讨论
本研究评估了16种市售单克隆抗体、细胞因子和免疫系统分子与水牛抗原的交叉反应性。结果表明，所有测试的mAb均与水牛抗原存在交叉反应性，除了抗CD4的mAb（克隆CC8），这验证了一个可用于水牛流式细胞术免疫表型分析的试剂组合，从而可以更深入地研究水牛的疫苗接种、传染病和免疫调节。
作者贡献声明
Elaine M. S. Dorneles：概念构思、数据整理、正式分析、资金获取、研究设计、方法论、撰写及审稿编辑、监督。
Ana Carolina Chalfun de Sant’Ana：研究设计、方法论、初稿撰写。
Flavio Sacchini：正式分析、研究设计、撰写及审稿编辑。
Wanessa A. Carvalho：正式分析、研究设计、撰写及审稿编辑。
Fabrizio de Massis：正式分析、研究设计、撰写及审稿编辑。
Maysa S. Gon?alves：
利益冲突声明
作者声明没有已知的财务利益或个人关系可能影响本文的研究结果。
致谢
本研究得到了巴西国家科学技术发展委员会（CNPq）（国家乳制品产业链科学技术研究所 - INCT – Leite II，项目编号CNPq 408.896.2024/8）和米纳斯吉拉斯州研究资助基金会（FAPEMIG）（项目编号RED-00132-22）的支持。KMGG感谢CAPES高级人才培养协调委员会提供的奖学金。MSG感谢FAPEMIG提供的奖学金。EMSD感谢CNPq提供的奖学金。
