绿色合成银纳米颗粒作为可持续纳米疗法的抗寄生虫效果与安全性评估：针对罗希塔鱼（Labeo rohita）体内暹罗锚头虫（Argulus siamensis）的疗效研究

《Veterinary Parasitology》：Antiparasitic efficacy and safety evaluation of green-synthesized Silver Nanoparticles as sustainable nanotherapeutics against Argulus siamensis in Labeo rohita

本研究利用印度榕叶提取物合成银纳米颗粒（NL-AgNPs），通过体外和体内实验验证其对抗寄生鱼蚤Argulus siamensis的杀灭效果，并评估宿主Labeo rohita的毒性反应。纳米颗粒在420 nm处呈现特征表面等离子共振峰，zeta电位-28 mV表明稳定性良好，剂量依赖性抑制寄生虫率达100%，96小时半数致死浓度9.12 mg/L，肝组织银积累量显著高于鳃部。病理学分析显示宿主各器官受损程度有效恢复，证实NL-AgNPs具有环境友好且高效的抗寄生虫潜力，但需进一步研究长期生物富集效应。

　　

普什帕·库马里（Pushpa Kumari）| 萨劳夫·库马尔（Saurav Kumar）| 拉吉夫·库马尔·布拉姆查里（Rajive Kumar Brahmchari）| K.V. 拉詹德兰（K.V. Rajendran）| S.P. 舒克拉（S.P. Shukla）| 鲁帕姆·夏尔马（Rupam Sharma）| 梅加·贝德卡尔（Megha Bedekar）| 拉姆·普拉卡什·拉曼（Ram Prakash Raman）

印度孟买ICAR-中央渔业教育学院水生环境与健康管理系，邮编400061

摘要

Argulosis病对淡水水产养殖构成了重大挑战，而传统化学治疗药物的使用因环境和可持续性问题的限制而日益受到约束。在这项研究中，使用Azadirachta indica（印楝）叶提取物合成了银纳米颗粒，并评估了它们对感染Labeo rohita的Argulus siamensis的杀虫效果。印楝叶合成的银纳米颗粒（NL-AgNPs）显示出特征性的表面等离子体共振峰（λ_max）位于420纳米，Zeta电位为-28毫伏，表明其具有良好的稳定性。这些纳米颗粒呈球形，平均尺寸为20±5纳米。傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析确认了负责纳米颗粒还原和稳定的功能基团的存在。在对L. rohita进行的急性毒性测试中，NL-AgNPs的96小时半数致死浓度（LC??）为28.25毫克/升，对照组未观察到死亡现象。体内暴露于NL-AgNPs后，7.05、14.12和21.19毫克/升的浓度分别实现了36%、75%和100%的杀虫效果，96小时半数有效浓度（EC??）为9.12毫克/升，治疗指数为3.10。环境扫描电子显微镜（ESM）显示，纳米颗粒在寄生虫表面的沉积呈剂量依赖性，导致严重的结构损伤并最终导致寄生虫死亡。ICP–OES分析显示，暴露14天后，肝脏中的银积累量（0.430微克/克）显著高于鳃部（0.31微克/克），且呈剂量依赖性趋势。此外，彗星试验显示，21.19和14.12毫克/升浓度下DNA损伤程度分别增加了15.49%（尾长：6.35像素）和7.27%（尾长：4.63像素）。组织病理学分析进一步表明，NL-AgNP处理后L. rohita的鳃、肝脏和肌肉中由Argulus引起的组织损伤得到了显著恢复。总体而言，绿色合成的AgNPs对Argulus siamensis显示出有希望的杀虫效果，而在Labeo rohita中观察到的毒性反应较轻。然而，需要进一步研究长期暴露、生物累积和净化动态，以评估NL-AgNPs在水产养殖中的长期安全性和可持续性。

引言

水产养殖是全球增长最快的食品行业之一（FAO，2024年）。然而，其发展日益受到传染病的威胁，尤其是寄生虫感染，这类感染占疾病爆发的74.88%，每年造成10.5至95.8亿美元的损失（Mishra等人，2017年；Sahoo等人，2020年；Shivam等人，2021年）。Labeo rohita（罗胡鱼）是最广泛养殖的鲤鱼品种，占鲤鱼产量的60%以上以及全球水产养殖产出的3.7%（Maharajan等人，2019年；FAO，2020年）。寄生虫是生态系统的重要组成部分，也是环境健康的指标；然而，集约化的水产养殖实践给鱼类带来了压力，增加了它们感染寄生虫的风险（Sures等人，2017年；Jer?nimo等人，2022年）。其中，由Argulus属引起的argulosis病是印度鲤鱼养殖中最普遍且经济影响最大的疾病之一，对鱼类健康和生长产生不利影响，增加了死亡率，并使鱼类容易受到二次感染，从而损害生物多样性和水产养殖生产力（Walker，2008年；Noga，2010年；Sahoo等人，2012年；Shameena等人，2021年）。Labeo rohita特别容易受到Argulus的侵害，尤其是在高密度养殖系统中（Kar等人，2016年；Mishra等人，2017年）。来自国家水生动物疾病监测计划（NSPAAD，2014–2018年）的先前数据也显示，Argulus属和Dactylogyrus属在淡水鱼类中的感染率最高（分别为19.51%和18.90%），强调了它们对印度水产养殖的巨大负担（Sahoo等人，2020年）。Sahoo等人（2012年）报告称，Argulus影响了印度近48%的水产养殖水体，估计每年每公顷造成的经济损失约为615美元。

为了应对argulosis病，已经有效使用了多种治疗措施，包括马拉硫磷（malathion）、对硫磷（parathion）、氰戊菊酯（cypermethrin）、伽玛克烷（gammexane）、阿维菌素（avermectin）、多拉菌素（doramectin）、伊维菌素（ivermectin）、苏米硫磷（sumithion）、三氯苯氧乙酸酯（trichlorfon）、埃玛菌素苯甲酸酯（emamectin benzoate）和敌敌畏（dichlorvos）等杀虫剂（Padmavathi和Prasad，1998年；Toovey和Lyndon，2000年）。高锰酸钾（potassium permanganate）、甲醛（formalin）、过氧化氢（hydrogen peroxide）和氯化钠（sodium chloride）等化学物质也被用于治疗Argulus寄生虫（Roth等人，1993年；Hakalahti等人，2008年）。一些如氟苯尼酮（diflubenzuron）和卢芬酮（lufenuron）等杀虫药物能够干扰几丁质合成和寄生虫发育，对鱼类的毒性较低，但对水生无脊椎动物的毒性很高（Plumb，1999年）。然而，这些化学物质对寄生虫的保护作用有限，并存在残留积累、抗药性产生、生态失衡、环境污染以及对宿主和人类健康的不良影响等风险（Lahav等人，1962年；Hemaprasanth等人，2012年；Bahmani等人，2014年；Rath等人，2016年；Kumar等人，2017年）。由于目前没有FDA批准的药物或可靠的可持续选项来控制这种外寄生虫，因此迫切需要环保、有效且长期的管理策略。

尽管植物疗法提供了一种可持续的替代方案，但它面临诸如效果不一致、缺乏标准化以及需要较高剂量等挑战（Kumar等人，2012年；Kumar和Kumari，2022年）。为了解决这些挑战，纳米技术应运而生，特别是用于合成具有强效杀虫特性的生物相容性、植物来源的纳米颗粒（Nasr-Eldahan等人，2021年）。植物的植物化学化合物可作为天然的还原剂、包覆剂和稳定剂，为纳米颗粒的合成提供了一种更安全、经济且环境可持续的替代方法（Zainurin和Zainol，2022年；Thakur等人，2024年；Akhter等人，2024年）。在各种植物中，Azadirachta indica（印楝）由于其多样的生物活性化合物而显示出用于纳米颗粒制备的巨大潜力（Kumari等人，2022年；Kumari等人，2023年）。在金属纳米颗粒中，银纳米颗粒（AgNPs）因其广谱抗菌和抗寄生虫活性而广受认可。在水产养殖中，它们已被证明对I. multifiliis（虹鳟鱼中的寄生虫）、Lernaea（金鱼中的寄生虫）、Cichlidogyrus（Pimentel-Acosta等人，2019年）和Tetrahymena（Valencia等人，2020年）有效。

AgNPs的潜在杀虫机制包括膜破坏、DNA损伤、氧化应激诱导和神经毒性（Paul等人，2016年；Daniel等人，2016年；Kumari等人，2024年）。银离子（Ag?）的释放使它们能够与寄生虫蛋白质中的巯基（thiol）、硫和磷基团相互作用，破坏膜完整性和酶功能，最终扰乱寄生虫的生理机能（Caito和Aschner，2015年）。尽管银纳米颗粒对多种鱼类病原体（包括寄生虫）的有效性已有充分记录，但其在水产养殖中的应用仍然有限。化学合成的AgNPs与脱靶毒性相关，对环境和宿主鱼类的健康都有危害（Khoshnamvand等人，2020年；Dang等人，2021年）。相比之下，绿色合成的AgNPs由于具有可生物降解性和环保特性，对宿主生物和环境的毒性显著较低（Younas等人，2022年；Shokouhi等人，2025年）。Argulosis病是鲤鱼养殖中的一个主要限制因素，尤其是在Labeo rohita中。尽管已报道化学合成的AgNPs对多种鱼类寄生虫具有杀虫效果，但关于绿色合成的AgNPs对argulosis病效果的系统证据仍缺乏。因此，本研究首次使用浸泡模型评估了绿色合成的银纳米颗粒对L. rohita中Argulus siamensis的杀虫效果，重点探讨了其杀虫机制和对宿主健康的影响。研究结果旨在填补这一关键知识空白，并确立绿色合成的AgNPs作为短期实验条件下argulosis病管理的可持续和环保纳米治疗策略。

节选内容

叶提取物的制备和银纳米颗粒的合成

从印度孟买ICAR-中央渔业教育学院的旧校区收集了Azadirachta indica（印楝）的叶子。按照先前描述的方法制备了水溶性叶提取物（Kumari等人，2025年）。提取物（滤液）在4°C下保存，待进一步分析。银纳米颗粒的生物合成按照先前方法（Rather等人，2017年）进行，稍作修改。将30毫升印楝叶提取物（NLE）加入360毫升1毫摩尔的溶液中

结果

在黑暗条件下孵育30分钟后，印楝叶提取物的颜色从黄绿色变为深红棕色。这种颜色变化表明AgNO?被还原为Ag?/Ag?，证实了银纳米颗粒的形成。在本研究中，AgNP的形成最初通过特征性的颜色变化来指示，通过紫外-可见光谱（UV-Vis spectroscopy）确认，显示λmax为420纳米（见图1）。此外，Zeta电位测量值为-28毫伏，表明其稳定性良好

讨论

在本研究中，向AgNO?溶液中加入印楝叶提取物后，反应混合物变为红棕色。这种颜色变化表明提取物中的植物化学物质还原了银离子（Ag?），从而形成了银纳米颗粒，这与先前的研究结果一致（Saratale等人，2018年；Saravanan，2021年）。合成的NL-AgNPs的UV–Vis光谱显示在420纳米处有一个尖锐的表面等离子体共振峰

结论

本研究表明，Azadirachta indica衍生的银纳米颗粒（NL-AgNPs）对L. rohita中A. siamensis的感染具有杀虫效果，突显了它们作为传统化学治疗药物的替代品的潜力。电子扫描显微镜（E-SEM）分析显示寄生虫表面明显受损和结构退化，提供了NL-AgNP介导的杀虫作用的机制见解。尽管较高暴露水平引起了轻微的基因毒性效应

未引用的参考文献

(Brahmchari等人，2023a；Caloudova等人，2018年；Das等人，2018年；Dos Santos等人，2024年；Dziendzikowska等人，2012年；Hakalahti-Sirén等人，2008年；Jahanbakhshi等人，2012年；Kumar等人，2012b；Kumari等人，2020年；Lafferty，2008年；Peter等人，2021年；Plumb，2002年；Sharma等人，2025年)

资助

本研究未获得公共部门、商业部门或非营利组织的任何特定资助。

伦理声明

在实验过程中遵循了ICAR-CIFE（印度孟买）的伦理指南（伦理批准编号524/GO/ReRcBiBt/S/02/CCSEA）关于动物护理的规定，数据得到了ICAR-CIFE水生环境管理委员会的支持和批准。

作者贡献声明

普什帕·库马里（Pushpa Kumari）：概念构思、数据管理、正式分析、研究方法、初稿撰写、审稿与编辑。萨劳夫·库马尔（Saurav Kumar）：概念构思、数据管理、研究方法、撰写、审稿与编辑。拉吉夫·库马尔·布拉姆查里（Rajive Kumar Brahmchari）：正式分析、资源提供、撰写、审稿与编辑。K.V. 拉詹德兰（K.V. Rajendran）：概念构思、资源提供、数据管理、撰写、审稿与编辑。萨蒂亚·普拉卡什·舒克拉（Satya Prakash Shukla）：研究方法、资源提供、监督、论文编辑。

CRediT作者贡献声明

梅加·贝德卡尔（Megha Bedekar）：资源提供、研究方法、数据管理。鲁帕姆·夏尔马（Rupam Sharma）：撰写-审稿与编辑、资源提供、研究方法、正式分析。S.P. 舒克拉（S.P. Shukla）：资源提供、研究方法、正式分析。K.V. 拉詹德兰（K.V. Rajendran）：撰写-审稿与编辑、资源提供、概念构思。拉曼·R.P.（Raman R.P.）：撰写-审稿与编辑、监督、项目管理、研究方法、正式分析、数据管理、概念构思。拉吉夫·库马尔·布拉姆查里（Rajive Kumar Brahmchari）：撰写-审稿与编辑

利益冲突声明

作者声明他们没有已知的可能影响本文工作的利益冲突或个人关系。

致谢

作者感谢ICAR-中央渔业教育学院（印度孟买）提供的所有必要设施。第一作者特别感谢比哈尔动物科学大学（印度巴特纳）提供的关键资源和行政支持，使得本研究能够顺利完成。