《Virus Research》：New viral sequences and endogenous viral elements (EVE) in world-wide populations of
Trioza erytreae, the African Citrus Psyllid
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【编辑推荐】为应对严重威胁全球柑橘产业的黄龙病（HLB），研究者对关键传播媒介——非洲柑橘木虱（Trioza erytreae）的病毒组进行了首次全球性分析。该研究在伊比利亚半岛、马德拉、加那利群岛、圣多美和普林西比、留尼汪岛及南非的虫群中，鉴定出7种新的昆虫特异性病毒、4种真菌病毒及3种柑橘病毒，并识别出22个活跃表达的内源性病毒元件（EVE）。该研究为理解该重要媒介的病毒组及其在HLB生物防控策略中的潜在应用提供了新见解。
论文解读：全球非洲柑橘木虱病毒组新发现——为抗击“柑橘癌症”探索新武器
被誉为“柑橘癌症”的黄龙病（Huanglongbing, HLB）是当前全球柑橘产业面临的最具毁灭性的威胁。这种由韧皮部限制性细菌“Candidatus Liberibacter”属成员引起的疾病，通过两种木虱——亚洲柑橘木虱（Diaphorina citri）和非洲柑橘木虱（Trioza erytreae, AfCP）进行传播。其中，AfCP是传播非洲种“Ca. L. africanus” (CLaf) 的天然媒介，并且已被证明能够高效传播最具攻击性的亚洲种“Ca. L. asiaticus” (CLas)。目前，欧洲大陆虽无HLB发生，但AfCP已成功入侵并定殖于伊比利亚半岛的坎塔布连和大西洋海岸，对欧洲（特别是西班牙）这个重要的柑橘产区构成了直接且迫在眉睫的威胁。由于HLB尚无有效疗法，控制策略主要依赖于对传播媒介的化学和生物防控。利用能够特异性感染这些媒介昆虫的病毒进行生物技术应用，是一种前景广阔的替代方案。然而，与对亚洲柑橘木虱病毒组的研究已取得相当进展不同，科学界对非洲柑橘木虱所携带或感染的病毒种群尚缺乏了解。这一知识空白，使得开发针对性的生物防控工具缺乏基础。为了应对这一挑战，一个国际研究团队在《Virus Research》期刊上发表了一项开创性研究，首次对全球多个地理种群的非洲柑橘木虱进行了全面的病毒组分析，旨在绘制其病毒“地图”，为未来基于病毒的生物防控策略寻找潜在“武器”。
研究方法概览
研究人员从伊比利亚半岛（葡萄牙和西班牙）、大西洋岛屿（马德拉、加那利群岛、圣多美和普林西比、留尼汪岛）以及南非的多个地点采集了非洲柑橘木虱成虫样本。研究采用基于高通量测序的宏转录组学方法进行分析。主要技术包括：（1）样品制备与测序：对每个地点的5只昆虫混合RNA进行提取，并使用核糖体RNA去除试剂盒富集非核糖体RNA，随后构建链特异性总RNA文库进行双末端测序，同时构建小RNA文库进行单端测序。（2）病毒序列鉴定：对测序数据进行质控、组装，得到的重叠群通过两种互补方法鉴定病毒序列：一是使用BLASTX比对NCBI病毒蛋白数据库，寻找与RNA依赖性RNA聚合酶、糖蛋白、衣壳蛋白和核蛋白的同源序列；二是使用Palmscan算法检测保守的RdRp基序。（3）序列性质与来源分析：利用同时可获得的相同虫群DNA测序数据，通过BLASTn比对区分病毒序列是存在于基因组中（DNA水平）还是仅从RNA转录。此外，将小RNA文库的reads比对到鉴定出的病毒序列上，通过分析sRNA的长度分布、链偏好性和5‘端碱基偏好性，来区分序列是来源于活跃的病毒感染（产生典型的21-23nt siRNA），还是来源于整合到昆虫基因组的内源性病毒元件（产生约30nt、5’端偏好尿嘧啶的piRNA），或是与昆虫共生的真菌中的病毒（产生22-23nt、5‘端偏好尿嘧啶的sRNA）。（4）病毒基因组重构与系统发育分析：对确认为活跃感染的病毒序列，通过RNA-seq reads的回贴（mapping）评估覆盖度，重构基因组结构，预测开放阅读框，并通过RdRp序列的系统发育分析进行病毒分类。
研究结果详述
1. 病毒序列的鉴定与分类
通过对来自多个地理位置的非洲柑橘木虱种群进行RNA测序和生物信息学分析，研究鉴定出大量病毒相关序列，并根据其在不同测序数据集（RNA-seq和DNA-seq）中的出现模式以及sRNA特征，将其分为几个主要类别。
2. 内源性病毒元件（Endogenous Viral Elements, EVE）的广泛存在
研究识别出一个包含22个序列的“第一组”（Scaffolds 1-22），这些序列在几乎所有采样点的DNA-seq和RNA-seq数据集中都被检测到。对其进行sRNA图谱分析发现，比对到这些序列上的sRNAs主要大小约为30个核苷酸，且至少一条链的sRNAs在5‘端富含尿嘧啶。这些特征符合PIWI-interacting RNAs (piRNAs) 的特点，piRNAs通常来源于内源性病毒元件，参与转座子和病毒序列的沉默。因此，研究者认为这22个序列并非代表活跃的病毒感染，而是整合到非洲柑橘木虱基因组中的EVE。这些EVE来源于多个病毒家族，包括RNA病毒家族的Chuviridae、Xinmoviridae、Sedoreoviridae、Orthomyxoviridae、Partitiviridae以及DNA病毒家族Parvoviridae。它们在所有被研究种群中的普遍存在，表明这些整合事件发生在种群扩散之前的进化史上。
3. 活跃感染的病毒：昆虫特异性病毒与真菌病毒
与EVE不同，研究发现了另一组“第二组”序列（Scaffolds 23-39），它们仅出现在特定地点的RNA-seq数据集中。其sRNA图谱显示出21-23nt的siRNAs，并具有对称的链分布，这是植物转录后基因沉默的特征，表明它们来源于活跃的病毒感染。这组病毒可进一步分为两个亚组：
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IIa亚组（昆虫特异性病毒）：sRNAs以21nt为主，5‘端无碱基偏好性。该亚组包含7种新的昆虫特异性病毒，分别属于Narnaviridae、Totiviridae、Solemoviridae、Phenuiviridae、Flaviviridae和Tombusviridae家族。其中，Phenuiviridae、Flaviviridae和Tombusviridae家族的病毒仅在南非种群中检测到。
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IIb亚组（真菌病毒）：sRNAs大小为22-23nt，5‘端偏好尿嘧啶，这是真菌病毒来源sRNA的典型特征。该亚组包含4种新的真菌病毒，分别属于Ambiguiviridae、Botourmiaviridae和Partitiviridae家族。值得注意的是，所有这些真菌病毒都仅在来自圣多美和普林西比的样本中检测到，研究者也在该样本的RNA-seq数据中鉴定出了真菌的核糖体标记基因，支持这些病毒来源于昆虫肠道菌群中的真菌。
4. 新发现的昆虫特异性病毒特征
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Trioza erytreae narna-like virus (TeNLV)：一种单组分正义单链RNA病毒，基因组3272nt，具有“双义”特征，正链编码RdRp，负链编码一个假设蛋白。在除留尼汪岛外的所有种群中均有发现，分布广泛。
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Trioza erytreae toti-like virus (TeTLV)：一种单组分双链RNA病毒，基因组5220nt，编码衣壳蛋白和RdRp，仅在圣多美和普林西比种群中发现。
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Trioza erytreae sobemo-like virus (TeSLV)：一种双组分正义单链RNA病毒，在圣多美和普林西比、留尼汪岛和三个南非地点发现。
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Trioza erytreae phenui-like virus (TePLV)：一种三分节段负义单链RNA病毒，仅在Gqeberha（南非）种群中发现。
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Trioza erytreae flavi-like virus (TeFLV)：一种长19250nt的正义单链RNA病毒，编码一个大聚蛋白，在Gqeberha和Stellenbosch（南非）种群中发现。
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Trioza erytreae tombus-like virus 1 (TeToLV1) 和 TeToLV2：两种与番茄丛矮病毒相关的病毒，前者为单组分，后者为双组分，均在三个南非地点发现。值得注意的是，TeToLV2与之前在亚洲柑橘木虱中发现的Diaphorina citri associated C virus (DcACV)具有高度同源性。
5. 植物来源病毒的检测
研究还在昆虫样本中检测到三种已知感染柑橘的病毒：柑橘脉突病毒、柑橘病毒A和柑橘衰退病毒。鉴于这些病毒仅在部分样本中低水平检出，研究者认为它们很可能来源于昆虫被捕前取食的植物残留在口器或消化系统中的物质，而非昆虫自身的感染。这凸显了宏转录组学方法的高灵敏度。
6. 病毒组的地理分布格局
一个重要的发现是病毒组的地理异质性。入侵欧洲大陆（包括伊比利亚半岛、加那利群岛和马德拉）的非洲柑橘木虱种群，除了广泛分布的TeNLV外，几乎不携带其他活跃感染的昆虫特异性病毒或真菌病毒，呈现出相对“无病毒”的状态。相比之下，在非洲本土（南非）以及圣多美和普林西比、留尼汪岛等岛屿的种群中，病毒多样性显著更高。对RdRp氨基酸序列的系统发育分析也支持种群的地理聚类，例如南非Stellenbosch和Buffeljagsrivier的病毒变种彼此更接近，而与Gqeberha的变种关系较远，后者又与留尼汪岛和圣多美和普林西比的变种更相似，反映了历史传播和多样化模式。
结论与重要意义
本研究首次系统描绘了全球范围内非洲柑橘木虱的病毒组图谱，揭示了一个包含活跃表达的EVE、新型昆虫特异性病毒、与其共生的真菌病毒以及植物来源病毒残留的复杂生态。其重要意义主要体现在以下几个方面：
- 1.
填补关键知识空白：彻底改变了对非洲柑橘木虱病毒组一无所知的状况，为理解这一重要HLB传播媒介的病毒-宿主互作奠定了基础。
- 2.
揭示EVE的免疫潜能：鉴定出22个活跃表达的EVE，涵盖了多个病毒家族，表明非洲柑橘木虱在其进化史上经历了多次广泛的病毒感染事件。这些EVE可能通过产生抗病毒piRNA，在昆虫的免疫防御中发挥作用。与亚洲柑橘木虱类似，半翅目昆虫基因组中富含EVE，这可能是该类群应对病毒压力的一个共同策略。
- 3.
发现潜在生物控制资源：鉴定的7种昆虫特异性病毒是未来开发生物防治剂的宝贵候选资源。它们可以作为“生物杀虫剂”直接控制媒介种群，或者经过改造成为载体，用于递送干扰HLB细菌传播的效应分子（例如通过RNA干扰技术）。
- 4.
指明差异化的防控策略方向：研究发现的病毒地理分布差异具有重要策略启示。欧洲入侵种群的相对“无病毒”状态，意味着它们可能对某些病毒缺乏预先存在的免疫（如相应的EVE或交叉保护），从而可能对引入特定的昆虫特异性病毒作为生物防治剂更为敏感。这为设计针对欧洲入侵种群的、基于病毒的精准防控策略提供了理论依据和潜在切入点。
- 5.
为比较病毒学研究提供素材：研究发现非洲柑橘木虱与亚洲柑橘木虱的病毒组在Narnaviridae、Totiviridae、Flaviviridae等家族上存在重叠，但也存在独特病毒（如Solemoviridae和Phenuiviridae成员），增进了对同科不同属媒介昆虫病毒组异同的理解。
总之，这项研究不仅极大地扩展了我们对昆虫媒介病毒圈的认识，更重要的是，它将病毒组的“地图”与HLB防控的实际需求联系起来，为开发新一代、环境友好的生物技术防控工具指明了潜在路径，为保护全球柑橘产业免受黄龙病摧毁带来了新的希望。
